牛牛天天人人综合影院 GREENspin全血RNA快速提取试剂盒

牛牛天天人人综合影院 GREENspin全血RNA快速提取试剂盒01
■ 适用范围：
适用于快速提取全血总RNA
本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
试剂盒组成 保存 50次 100次
10X红细胞裂解液RLB 室温 25 ml 50ml
裂解液RLT 室温 50 ml 50 ml×2
去蛋白液RW1 室温 40 ml 80ml
漂洗液RW 室温 15ml                   15ml×2
*次使用前按说明加量乙醇
RNase-free H2O 室温 10 ml 20ml
70%乙醇 室温 9ml                   18ml 
*次使用前按说明加量乙醇 
RNase-free
吸附柱RA和收集管 室温 50套 100套
牛牛天天人人综合影院 GREENspin全血RNA快速提取试剂盒
■ 试剂盒组成、储存、稳定性：
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■ 储存事项：
1.  所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该
直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
2.  不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因
此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。
3.  避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应
及时盖紧盖子。
■ 产品介绍：
红细胞裂解液选择性裂解红细胞,然后*的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解白细胞和
灭活细胞RNA酶，然后用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离
心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将细胞代
谢物，蛋白等杂质去除， zui后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
■ 产品特点：
1.  离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界公司特制吸附膜，柱与柱之间
吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.  不需要使用有毒的苯酚,氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
3.  反复优化的红细胞裂解液配方,裂解效果快速*。
4.  快速，简捷，单个样品操作一般可在40分钟内完成。
5.  多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.9～2.0，基本无
DNA残留,可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。
目录编号  包装单位
01 50次
02 100次03 04
■ 注意事项：
1.  *次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入量乙醇，加入后请
及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
2.  所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13，000 rpm的传统台式离
心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
3.  需要自备乙醇, β-巯基乙醇,一次性注射器,研钵。
4.  裂解液RLT 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免
沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5.  预防RNase 污染，应注意以下几方面：
1)  经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。
2)  使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3)  RNA 在裂解液RLT 中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用
不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 小时，塑料器皿可在0.5 M 
NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水*清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4)  配制溶液应使用无RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至
终浓度0.1%( v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）
6.  关于DNA 的微量残留：
一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法*避免DNA的微量残留,本公司
的GREENspin系列RNA提取产品，由于采取了本公司*的缓冲体系和选择了特殊吸
附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染
色紫外灯下观察不可见）影响不是很大, 如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定
量PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时：
1)  选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与
扩增反应。
2)  选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
3)  将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I处
理后的RNA清洁(cleanup),请索取具体操作说明书。
4)  在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase  I处理。请
我们索取具体操作说明书。
7.  RNA 纯度及浓度检测：
完整性： RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳  (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳
缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA，电泳后
UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb，分别相
当于28S 和18S  rRNA。动物RNA 样品中zui大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 
倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，
OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受
测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出
的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但
这并不表示RNA 不纯。
浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水将
分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的
计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×4005 06
牛牛天天人人综合影院 GREENspin全血RNA快速提取试剂盒
■ 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
提示：
→  *次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入量无水乙醇!
→  使用前将10X红细胞裂解液RLB用DEPC处理水稀释到1X。
→  操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml RLT 中加入10μl 
β-巯基乙醇。此裂解液现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。
1.  在适合大小的RNase  free离心管中加入1体积（<1.5 ml）加入各种抗凝剂新
鲜血液 (颠倒混匀后)和3体积的红细胞裂解液RLB,颠倒混匀,可轻弹管壁,确保混匀。
2.  室温放置10分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞）。
如果RNA降解严重,可在冰上裂解,但是时间可长一些以充分裂解。
3.  12,000  rpm离心20秒，倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意
不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团。 
离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一
起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入红
细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤2，3。
上清尽可能的吸弃,残留过多会稀释裂解液,造成裂解结合异常,产量纯度降低。
4.  涡旋或者轻弹管壁将白细胞沉淀*松散重悬，加入350μl（<0.5 ml全血）或
者600μl（0.5-1.5ml全血）裂解液RLT，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。病
人血样中白细胞数量可能大幅增加,应该适当减少处理量。或者按照350μl（<2x106白
细胞）或者600μl（2x106-1x107白细胞）比例加RTL。
5.  用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9mm针头) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到
得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。
6.  较估计裂解物体积,加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙
醇!）,此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。
7.  将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱
放入收集管中）13,000 rpm离心30-60秒，弃掉废液。
8.  加700μl 去蛋白液RW1，室温放置30秒，12，000rpm 离心30秒，弃掉废液。
如果DNA残留明显,可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。
9.  加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000  rpm 离心
30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW,重复一遍。
10. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000  rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免
漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
11. 取出吸附柱RA，放入一个RNase  free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜
的中间部位加40-60μl RNase  free water（事先在 70-80℃水浴中加热效果更好）， 
室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。
12. 如果提取全血>0.5 ml或者>2x106白细胞,加40-60μl RNase  free water重复
步骤11,合并两次洗脱液,或者使用*次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要
RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–
30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。