1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2. 将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯zui近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。

3. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，竖直放好。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1.5ml胰酶液，悬空移入培养瓶内。

4.  将培养使胰酶浸没整个瓶壁的细胞层，计时约40s，立马竖起对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，这时为胰酶消化的zui适时机。若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，则需继续消化，轻轻的迅速平放培养瓶使胰酶浸没细胞层1s后迅速竖起对着灯光观察细胞情况，可反复几次，直至出现针孔样缝隙和1-2个细胞脱落的消化状态。用移液器将胰酶吸净。

5. 吸取1ml细胞冻存液于培养瓶内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞*脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。

6. 将1ml含有细胞的冻存液移入新的保种管内，拧紧瓶盖，做好实验标记。

7. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

8. 将保种管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱过夜，次日再放于-80℃的冰箱内3-4天，zui后存放于-196℃的液氮灌内经久保存。

   注此过程也可简化因实际操作过程中经验所得：步骤7结束后将保种管用干脱脂棉包裹后胶带封好直接放于-80℃冰箱内4-5天，即可放于液氮灌保存。但-80℃冰箱也可保存细胞株2-3月。