注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、
蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机
体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。
测定原理
AP-TEMED 系统产生超氧阴离子，与盐酸羟胺反应生成 NO2－，NO2－与对氨基苯磺酸和 α－
萘胺的作用生成红色的偶氮化合物，在 530nm 处有特征吸收峰，样品对超氧阴离子的清除
能力与 530nm 的吸光值呈负相关。
自备实验用品及仪器
天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、恒温水浴锅。
试剂组成和配制
提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 2mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加 8mL 蒸馏水充分溶解。
试剂三：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
试剂四：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂五：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。
样品处理
1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL
提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃，10000g 离心 10min，取上清置于冰上待测。
2. 细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500
万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，
总时间 3min）；然后 4℃，10000g 离心 10min，取上清置于冰上待测。
3. 培养液或其它液体：直接检测。
4. 粉剂药物可配制成相同浓度，比如 1mg/mL。
| 空白管 | 对照管 | 测定管 |
试剂一（μL） | 40 | 40 | 40 |
试剂二（μL） | | 160 | 160 |
H2O（μL） | 260 | 100 | |
充分混匀，25℃反应 1min |
样品（μL） | | | 100 |
试剂三（μL） | 200 | 200 | 200 |
充分混匀，37℃反应 30min |
试剂四（μL） | 200 | 200 | 200 |
试剂五（μL） | 200 | 200 | 200 |
充分混匀，37℃显色 20min，于 1mL 玻璃比色皿，以空白管调零，在 530nm 处测定对照管 和测定管的吸光值，分别记为 A 对照管和 A 测定管。 |
计算公式
超氧阴离子清除率 I%=
A对照管 - A测定
A对照管
´100%
注意事项
1. 试剂一 4℃可保存 2 个月，配制好的试剂二 4℃可保存一周，建议实验前配制，并尽快
使用。
2. 样品处理完后立即进行测定，或者低温保存不超过 24 小时。
