如果将试剂盒刚从冰箱里面拿出来就立即使用的话，可能会影响ELISA试剂盒后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。建议：先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，ELISA试剂盒以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面的温育中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步(图15-5)。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA试剂盒提高到新水平。
    在一步法测定中，应注意钩状效应(hookeffect)，类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。
(三)间接法测抗体
     间接法是检测抗体zui常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
(1)将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
(2)加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，ELISA试剂盒在洗涤过程中被洗去。