在一些情况下，例如需要对真核微生物的代谢途径进行修饰，或者需要表达的真核生物蛋白需要合适的翻译后修饰才具有生物活性时，就需要采用真核微生物表达载体。真核细胞基因表达调控要比原核细胞基因复杂得多，用于真核细胞的克隆和表达载体也不同于原核细胞。目前所用的真核载体大多是所谓的穿梭载体(shuttle—vector)。

    穿梭载体是指可以在不同宿主细胞中复制的载体，其中的一个宿主通常是大肠杆菌。这种载体必须既含有大肠杆菌或其质粒的复制起点，又含有另一生物或其质粒的复制起点。由于利用大肠杆菌进行重组DNA技术的各种操作都zui为方便，因此通常先利用大肠杆菌体系构建好所需的表达载体并大量复制后，再转到其他细胞中去表达。

    用于真核生物基因表达的穿梭载体应至少具备以下特征：①含有原核基因的复制起始序列以及筛选标记，以便于在E．coli细胞中进行扩增和筛选；②含有真核基因的复制起始序列以及真核细胞筛选标记；③含有有效的启动子序列，保证其下游的外源基因能启动有效的转录；④应包含RNA聚合酶II所需的转录终止序列和poly A加入的信号序列；⑤具有合适的供外源基因插入的限制性内切酶位点。值得注意的是，与原核宿主一载体系统常用的抗生素抗性标记不同，真核宿主一载体系统所采用的选择性标记除了kanr基因(抗G418)等少数抗性标记外，更常用的主要是营养缺陷型。例如，通常宿主为某一营养缺陷型(如ura3—52、his3一△ι、leu2一△ι、trpι一△ι和ιys2一201)，而载体上则携带相应的基因(如URA3、HIS3、LEU2、TRPι和LYS2)。由于宿主在基本培养基上不能生长，而重组子能够生长，因此可以用基本培养基来筛选重组子。

    目前研究得比较多的真核微生物表达体系之一是酿酒酵母表达系统。以酿酒酵母为宿主的常见载体有以下几类。

(1)YEp载体YEp是酵母附加体质粒(yeast episomal plasmid)的缩写。附加体是指游离于染色体之外的独立复制DNA分子。YEp载体由大肠杆菌质粒、部分或全部酵母2μ质粒以及酵母染色体的选择标记构成。由于2μ质粒内含自主复制起点(ori)和使质粒在酵母细胞中稳定存在的STB区，所以这类载体在酵母细胞中独立存在。

(2)YIp载体YIp是酵母整合型质粒(yeast integrating plasmid)的缩写。YIp载体由大肠杆菌质粒和酵母的染色体DNA片段组成，可与宿主的染色体DNA同源重组，整合进入宿主染色体中，从而随宿主染色体一起复制。

(3)YAC载体YAC载体是酵母人工染色体(yeast artificial chromosome)的缩写，是由酵母染色体中分离出来的DNA复制起始序列(ARS)、着丝点(CEN)、端粒()以及酵母选择性标记组成的能自我复制的线性克隆载体。YAC载体通常可以以双链环状DNA的形式在大肠杆菌中复制，然后用限制酶消化成线性分子。多数YAC载体可以克隆250~400kb的外源DNA，在人类基因组计划中发挥了重要作用。

    除酿酒酵母外，以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、汉逊多形酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluueryomyces lactis)等为宿主的酵母表达系统也得到迅速发展并被广泛应用。