通过使用免疫方法测定抗原和抗体间的结合，可以检测出溶液中抗原和抗体的浓度。临床实验室zui常用的免疫测定技术可以分为两类。*类是敏感度相对来说不那么高的技术，它包括以光散射和凝胶沉淀为原理的方法，这些方法中，抗体和抗原结合后发生生物物理学变化，然后产生信号（如形成沉淀）。第二类技术包括RIA、EIA、荧光免疫测定和化学发光免疫测定，在检测抗体与抗原间的结合时，这些方法需要用放射性核素，酶，荧光或能发光的分子修饰抗原或抗体试剂。不论哪一种技术，为定量检测浓度而转换结合信号时都要求使用标准曲线，该标准曲线中，加的是已知量的反应物。
使用光散射来检测单克隆抗体与可溶性抗原的结合就说明了这个原理。6抗原和抗体在溶液中相互作用后形成分子复合物，该复合物比两种反应物的分子量都要大。光散射强度与分子量的平方成比例，7可以把抗原抗体复合物的形成描述为有更多的光散射，而不是由各蛋白质产生的光散射的总和。例如，将含单克隆抗体的溶液放置于比浊计中，然后加入递增量的抗原。抗原-抗体复合物产生光散射的增量比抗原抗体单独产生的光散射要大。光散射图的转折点出现在抗原与抗体的克分子浓度比等于2的地方。在这一点，抗体与抗原的反应达到饱和，因为每个IgG抗体分子都有两个结合位点。低于饱和点的任何一处，都有一个*的光散射信号与抗原浓度相对应。用已知浓度的抗原溶液可以得到光散射信号的强度，进而得出标准曲线。如果检测一个未知的标本，产生一个光散射信号y，那么从标准曲线就可定义出抗原的浓度等于x。所有的定量免疫测定都遵循下列原则。那就是（1）抗原-抗体复合物的量与被结合的抗原量成比例，（2）信号（如光散射）与抗原抗体复合物的量成比例，（3）用已知浓度的抗原标准化信号，（4）用标准曲线把信号转换成浓度检测。

实践中，本例描述的散射光信号很小以致于它仅用于检测纯化的单克隆抗体和纯化的抗原之间的结合作用。血清中别的蛋白质的散射光背景会掩盖抗原-抗体复合物的散射光。抗体与抗原结合后会出现内在的变化，因此，大多数以此为原理的免疫测定方法都会使用多克隆抗血清，并以抗原-抗体的沉淀反应为原理。因为大多数抗原都有好几个可以被抗体识别和结合的位点，大多数抗血清也含有好几种可以识别同一抗原分子不同结构的抗体。因此，在典型的抗原-抗体反应中，一个单独的抗原可以有很多的抗体结合到它的表面。由于每种抗体分子都有两个结合位点，那么与*个抗原结合的抗体都可以再与另一个相同的抗原结合，而每个抗原分子又可能有许多的抗体与之结合。这种交叉结合（或交叉连接）的现象导致了大量的不可溶的抗原抗体复合物的形成，该复合物叫晶格。晶格的形成是由于抗体双价的结合结构以及抗原多结合位点的出现。抗原过量时，抗体被饱和，没有足够的抗体与复合物交叉连接。抗体过量时，抗原被抗体饱和，没有足够的抗原与复合物交叉连接。使用单克隆抗体而不是多单克隆抗血清时，每个抗原只能与一个单独的位点结合，不会有交叉连接（或晶格形成）出现。

沉淀反应是zui早被描述的抗原抗体反应之一。8.9可以在某种介质如琼脂里进行反应，琼脂允许蛋白质分子扩散或电泳但大的，不溶性的抗原-抗体复合物却不行。以琼脂为基础，zui常用的定量免疫化学技术是放射免疫扩散（RID）。10 RID是zui简单可靠的免疫测定技术之一，但它也有有一些缺点。沉淀反应发展缓慢，有时需要好几天才能得出结果。单*个测定，能被分析的未知的东西很有限，且此技术相对来说灵敏度不是很高。进行RID时，先在玻璃板上铺一薄层琼脂，整个琼脂内均匀地含有溶解的抗体试剂。在琼脂*打一小孔，孔里放置（标准或未知的）抗原，接着抗原在琼脂内扩散，形成一个浓度梯度。抗原在琼脂内移动时，被抗体结合，但在孔附近的抗原过量带，抗原-抗体复合物仍保持可溶。抗原和抗原-抗体复合物继续扩散，直到等价带中有足够的抗体被结合形成抗原-抗体复合物晶格。等价带中形成的沉淀在含抗原的孔周围形成环状。标本中抗原浓度越高，等价带中需要的抗体越多，沉淀环的直径越大。沉淀环的平方（即面积）与抗原的浓度成正比。

典型的RID测定是：把抗体加入到融化的琼脂中，然后把琼脂倒在一玻璃载玻片上，让它凝固。在凝胶中打孔，各孔中分别加入未知标本和一系列已知浓度的抗原标准物。将载玻片置于湿的温箱中孵育30分钟到2小时，然后就可以测定沉淀环的直径。RID不需要特殊仪器，临床上许多小的实验室都使用该技术。

也可用比浊法来对沉淀反应进行定量。比浊法比凝胶技术更敏感、更快速，且能自动化。如前边所提到的，比浊法检测的是被散射的光，散射光的强度与溶液形成的抗原-抗体复合物的分子量的平方成比例。在终点（平衡）比浊法中，抗原和抗体孵育30分钟到2小时，测定散射光，将它和标准曲线对比，该标准曲线上的散射光与抗原浓度相对应。在速率比浊法中，抗原与抗体混合后，在很短的一段时间内，立即检测多个散射光，通过这样，可以测定出抗原-抗体复合物形成的起始速率。散射光形成的速率越快，表明抗原抗体复合物形成的速率越快和抗原的浓度越高。比浊免疫分析法快速、可靠、容易实现自动化。利用商业提供的设备和抗体试剂，许多蛋白质都可以在临床实验室常规检测。自动化的比浊法也可用于血清Igs(包括IgE),白蛋白,C3,C4,转铁蛋白, α1抗*,C反应蛋白,C1 酯酶抑制因子的定量检测;尿液中肌球蛋白和白蛋白水平的测定;以及脊柱液中IgG和白蛋白水平的检测。
第二类免疫测定需要用一种“通讯群体"对反应物（抗原或抗体）中的一个进行修饰。放射性核素，酶，荧光染料或发光的分子都可用做出现了抗体结合抗原的信号。这些方法在技术上实施起来更困难，但它们都是必要的，因为生物标本中微量（ng/ml）抗原或抗体的检测和定量都要求更高的灵敏度。zui先描述RIA的原理是1960年胰岛素的测定，而且这门技术是灵敏度zui高的技术之一。11 典型的竞争性替代RIA中：先放射性标记抗原，然后将标记抗原与抗体一起孵育，再把与抗体结合的标记抗原与未结合的抗原分离，zui后检测已结合的放射性活度。如果在加入标记抗原的同时也加未标记的抗原，未标记抗原就会竞争有限的抗体结合位点，与被提供的抗体结合的标记抗原就变少。试管里含固定量的标记抗原和抗体，如果往里加入递增浓度的未标记抗原，就可构建一条标准曲线。这种方法叫竞争替代法因为抗体试剂的量不足以结合所有标记和未标记的抗原分子。做这个实验时，临床医生一定要有特异性的抗血清或单克隆抗体，纯化的放射性标记的抗原，纯化的未标记的抗原标准物，以及分离结合跟游离抗原的方法。多数RIAs都是用125I放射活性通讯群体，用γ闪烁记数仪检测发出的放射性活度。由于具有敏锐的分析灵敏度，RIAs的用处很大，但由于放射性核素的使用，它们的放置时间又很短。zui常见的分离技术是使用第二抗体，该抗体能跟*抗体反应形成沉淀。已结合的放射性标记的抗原跟复合物一起沉淀下来，通过离心分离结合和游离的放射性活度。zui近，已设计出一些使用固相结合抗体的方法。这些方法中，抗体结合于固相表面，如试管内壁或聚苯乙烯珠粒。往试管里加入标准或未知抗原以及放射性标记抗原后，通过简单地倾倒试管或移走珠粒就可分离结合和游离抗原。

固相结合抗体的使用引致了“三文治"免疫测定的发展，也叫两位点免疫测定方法（IMAs）。在这一类型的方法中，临床医生纯化和放射性标记第二抗体而不是标记纯化的抗原。*抗体与固相结合，然后加入抗原，zui后通过加入放射性标记的第二抗体，该抗体也能与抗原结合，就可以检测与固相结合的抗原。随着更高浓度的的抗原标准物的加入，更多的标记抗体与固相结合，从而形成一条标准曲线。免疫放射测定（IRMA）技术的优点是标记的是纯化的抗体而不是纯化的抗原。抗体是稳定的蛋白质分子，容易被放射性核素、酶和能发光的分子标记上。但有些抗原在化学标记过程中却有可能被改变或遭到破坏。

如前所述，两位点IMA的基本原理是可以使用多种通讯群体。也就是说，除了使用放射性核素标记的第二抗体，第二抗体还可与酶或发光分子结合，然后用分光光度计或发光计而不是用γ闪烁记数仪来定量检测结合抗体。如果用的是酶标记，该方法叫EIA。典型的EIA是通过加入底物溶液来定量检测已结合的酶连第二抗体，该底物被酶水解后颜色发生改变。因此，加入到试管里的抗原越多，被结合的酶连二抗也越多，同时，在给定的时间内，颜色强度的变化也越大。许多EIAs都用微量滴定板进行，然后用自动分光光度计定量，该分光光度计能直接读取多孔板的吸光度。EIAs有好几个优点：不使用同位素，试剂有较长的放置时间，没有废物处置问题。三文治EIA方法的分析灵敏度与竞争性替代RIA相近。