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男女呻吟久久免费视频 免疫染色的注意问题

时间:2016/1/15阅读:1370
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1.免疫染色可在细胞涂片或组织切片上进行免疫染色。首先,标记抗体与标本中抗原反应结合。其次,用PBS吸取未结合成分。zui后,直接观察结果(免疫荧光直接法)或显色后再用显微镜观察(免疫酶直接法)。在此基础上发展出间接法、多层法,双标记法等各种方法。在免疫染色中应特别注意增强特异性染色,减少或消除非特异性染色。在各种免疫染色中都应注意以下几个问题:

(1)增强特异性染色方法

1)蛋白酶消化法:目的是暴露抗原,增加细胞和组织通透性,使抗原抗体zui大限度结合,增强特异性染色和避免非特异性染色。该法已广泛用于各种免疫细胞化学染色。常用蛋白酶有、及等;酶消化时间和温度因各种抗原对消化的敏感性不同,应根据酶活性通过预实验确定,消化时间还与组织固定的时间有关,越陈旧固定组织所需时间越长,以37℃为宜。

2)适宜的抗体稀释度:抗体浓度是免疫染色关键步骤。浓度过高,抗体分子多于抗原决定簇,可导致抗体结合减少,产生阴性结果。

3)温育时间:一般抗体温育时间为30~60min,必要时可4℃过夜。温育温度常用37℃,也可在室温中进行。37℃可增强抗原抗体反应,适用于多数抗原染色,但应注意在湿盒中进行,防止切片干燥而导致失败。

4)多层染色法:对弱抗原可用直接法(双层)、辣根过氧化物酶一抗过氧化物酶(PAP)和抗一(ABC)法(j层),四层或五层PAP法或ABC法,或PAP和ABC联合染色法等,可很大程度提高敏感性,获得良好结果。

5)其他增敏方法:如微波处理法、酪氨酰胺信号放大技术(tyramide signal smplmcation,TSA)增敏方法以及免疫PcR方法等。

(2)减少或消除非特异性染色的方法:组织中,非抗原抗体出现的阳性染色称为非特异性背景染色,zui常见原因是蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上。有效消除方法是在用*抗体前,加与制备*抗体相同的动物的非免疫血清(1:20~l:5),封闭组织上带电基团而除去与*抗体非特异性结合。必要时加入2%~5%牛血清白蛋白,可进一步减少非特异性染色,作用时间为lO~20min。

(3)显色反应的控制:免疫酶染色应注意:1)成色质浓度和反应时间。增加成色质的量和(或)增加底物反应时间,可增加反应产物强度,着色太深可减少反应时间。2)过氧化物酶显色时,H2O2浓度较大将使显色反应过快而导致背景加深,过量H2O2可抑制酶活性。

(4)复染:根据所用实验方法和呈现颜色不同,可选用适当复染方法。如阳性结果呈红色或棕色,则用苏木素将细胞核染成蓝色,以便定位检测。

4.对照设对照目的在于tiEBIj阳性结果的特异性,排除非特异性结果。主要针对*抗体对照,常用对照方法包括:阳性对照、阴性对照、阻断试验、替代对照、空白对照、自身对照和吸收试验。

5.免疫细胞化学结果判断对免疫细胞化学结果判断应注意几点:①准确判断阳性和阴性,排除假阳性和假阴性结果,必须严格对照试验,对新发现阳性结果,除有对照试验结果之外,应进行多次重复试验,并用几种方法进行验证。②判定特异性染色和非特异性染色:特异性反应产物常分布于特定部位,且在同一切片上呈现不同程度阳性染色结果。而非特异性染色表现为无一定的分布规律,常呈某一部位成片的均匀着色,细胞和周围结缔组织均无区别着色,或结缔组织呈现很强的染色;常出现于干燥切片边缘,有由于过强刀痕或自制折叠的部位;在过大组织块,中心固定不好也会造成非特异染色。当非特异性染色和特异性染色同时存在时,过强的非特异性染色背景会影响对特异性染色结果的观察和记录。

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