农杆菌介导人胰岛素ELISA法检测研究
农杆菌介导转化其转化效率受到多种因素影响。随机挑选5个抗性菌落进行验证，PCR检测结果表明，人胰岛素基因已经整合到银耳基因组中；RT-PCR结果显示，在银耳细胞中可以检测到人胰岛素基因的mRNA；Southern杂交结果表明人胰岛素基因以单拷贝的形式整合到银耳基因组DNA中。本试验通过设置农杆菌与银耳芽孢不同共培养时间、诱导剂乙酰丁香酮的浓度、银耳芽孢及农杆菌浓度等因素对转化效率影响，结果在乙酰丁香酮浓度为500μmol/mL、银耳芽孢浓度为108个/mL、农杆菌OD=0.5及共培养时间为2d时，转化效率zui高，为310个转化子/108个银耳芽孢。转化子转接5代后对潮霉素仍有抗性，说明外源基因在银耳芽孢中能够不乱遗传。在实验室已初步建立的农杆菌EHA105介导银耳转基因方法的基础上，以银菌株Tr21-01为出发菌株，通过冻融法将携带有潮霉素磷酸转移酶(Hph)基由于遗传标记及人胰岛素基因(BAC)为目的基因的质粒pBHg-BCA导入根癌农杆菌GV3101，LBA4404和AGL-1中，并进一步介导转究。实验结L-1具有较高的转化率；GV3101转化率较低，且假阳性较高；LBA4404无抗性菌落长出。此结果表明不同的农杆菌侵染银耳芽孢能力具有差异性，且对受体侵染具有一定的特异性。本实验以农杆菌EHA105为参照菌株，对农杆菌AGL-1介导转化银耳进行研究。基于农杆菌介导转基因受诸多因素的影响，本实验从农杆菌与银耳芽孢共培养时间、银耳芽孢浓度、农杆菌浓度、诱导剂乙酰丁香酮(AS)的浓度、转率等方面进行优化。其转化前提优化结果为：AGL-1菌液OD值为0.4～0.5，AS诱导培养浓度为250μg/mL、共培养浓度为150μ耳芽孢浓度为10~8/mL，共培养72h转化率zui高，可达500个/10~8，且阳性菌落为89%；EHA105菌液OD值为0.4～0.5。
