问题

可能原因

解决方法

无颜色

试剂孵育的时间没有按说明书操作。

确定*化抗体，联接的hrp试剂或链霉亲和素-hrp使用的时间是否适当。

不同试剂盒或不同批号的试剂混用。

重新检查试剂的标签，确保所有组分都属于正使用的试剂盒。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。

漏加酶

检查操作流程，注意不要漏加

hrp酶污染了叠氮钠

使用新配制的试剂，禁含叠氮钠

标准品有问题（若在标本孔中有信号）

按说明书检查标准品的配制过程

使用1瓶新标准品

某一容器未洗净,残留灭活酶物质

尽可能用试剂盒内容器,另觅一定要洁净、可靠

使用含血清的缓冲液配制/复溶抗体

重新确认所选用的试剂

.漏加显色剂a或b

加显色剂后观察孔中液面高度

试剂配制/使用有误

将实验重做；严格按说明书操作，每次配制和使用前看清标签。

缓冲液污染

配制新鲜的缓冲液

显色弱

超过有效期的产品可能会产生很弱的信号。

检查产品的有效期

加入试剂的体积和时间有误

确定所使用的每一个试剂的体积正确和加入时间是适当。

试剂、样品用前未能平衡

用前试剂、样品置室温平衡10分钟左右

缩短孵育时间能使实验的信号变弱。

检查孵育的时间。

在温度变化的环境内孵育酶标板。

确定孵育的温度，应避免温度的变化。

使用了被污染的试剂

检查试剂是否被污染。

标准品/标本制备方法不规范

检查标准品/标本的制备，标准品应按说明书进行复溶和稀释。低温贮存的标本避免反复冻融，严禁使用溶血标本。样品用nan3防腐,抑制了酶的反应

显色底物制备不规范

检查底物的制备，如体积是否正确，混合是否恰当充分。

检测时间不当

是否在规定的时间内检测。

仪器设定不正确，滤光片不匹配。

仪器是否设定正确，滤光片的选择是否相符等。

高背景（本底）

洗涤操作不规范

洗板不充分，使用手工洗板常出现。使用洗板机，或使用洗瓶洗涤。每孔应*充满洗涤缓冲液，倾出时应迅速。若使用洗板机，应校准并设定足够充满每孔的体积量。板的内侧不应接触设备。

检查每孔是否有残留的洗液或每孔加样量的体积是否准确。在两次洗板之间加30秒的浸泡。

实验中孵育温度和时间不适当

确定每一实验步骤的孵育温度和时间是否适当

酶加量过多

加酶前验看移液器调节量是否准确。

检查稀释度，必要时需做效价测定试验。

封闭不*

检查封闭液的计算量；延长封闭时间。

标本或标准品中的干扰物质

做适当的对照

显色剂受光照时间较长,或污染

显色剂a和b应于使用前10分钟从冰箱取出

整批样品放置时间过长,样品污染

样品应保持新鲜,或低温保存,防止污染

缓冲液污染

制备新鲜的缓冲液

吸头重复使用,未洗净或消毒不*而用于加酶或显色剂

吸头尽可能一次性使用

太多的信号：

全部的板子变成规则的蓝色

不充分的洗涤/洗涤步骤被遗漏-没结合的过氧化物酶仍有残留。

使用洗板机充分洗涤

检查孔内是否有残留的洗液或加样量是否准确。

底物溶液混合太早并转成蓝色

应控制底物混合的时机并立即使用

太多的酶结合物

检查稀释度，必要时进行效价测定

封板膜或试剂容器被重复使用，导致hrp残留，使tmb底物产生非特异蓝色。

使用新的封板膜，每步使用不同的试剂容器

缓冲液中污染金属或hrp

制备新鲜缓冲液

高cv值（cv：coefficient of variation），花板

操作不慎或洗涤不充分

按说明书洗板、加样、显色。洗板尤为重要，如上所述

出现干板，没有使用封板膜、封板膜重复使用

确定每两步骤间，酶标板应保持湿润。

使用封板膜封口，注意每步使用新的封板膜。

由于操作失误或板子质量差（结合不均匀）造成包板不均匀。

稀释用的pbs中不要加其它蛋白

检查包被和封闭液体积、时间和试剂加入的方法。

检查所使用的酶标板，使用elisa板（不要使用组织培养板）

移液器不准确，吸头重复使用。

检查并校准移液器。每次取样必须换吸头。回顾标本的加入步骤，确保每次加样的准确性，保证吸取的液体按所设定的体积吸入和排出，连续加样时注意检查吸头，确保所加液体的体积。

样品离心处理不全,反应孔内发生凝血或残留细胞成分

标本充分离心, 3000rpm 6分钟以上，严禁使用凝血（溶血）的标本

缓冲液污染

制备新鲜的缓冲液

标准曲线可得到，但两点之间区别很差（低或平的曲线）

酶结合物不足

检查稀释度，必要时进行效价测定

捕获抗体没有很好结合到板上

检查所使用的酶标板，使用elisa板（不要使用组织培养板）

稀释用的pbs中不要加其它蛋白

检测抗体不足

检查稀释度，必要时进行效价测定

板子显色不足

延长底物孵育实验

使用推荐品牌的底物溶液

操作不慎

回顾elisa操作流程，消除任何擅自修改的程序。

标准曲线稀释度计算有误

核查计算的情况，制备新的标准曲线

标准曲线很好，但是没有任何期望的阳性信号产生

在标本中无相应的细胞因子

使用内参对照

重复实验，重新考虑实验的相应参数

标本基质遮盖检测

将标本至少做1∶2相应的稀释，或进行系列稀释观测它的恢复性

标准曲线很好，但是标本的判读值很高

标本中含的细胞因子水平超过检测范围

将标本做稀释并再次实验

当使用hrp酶结合物时，tmb底物加终止液后显绿色

孔中的试剂显色不充分

轻轻振荡板子

边缘效应

工作环境温度不均衡

避免将酶标板在变化温度环境中孵育

漂移

实验过程中出现间断

整个实验应连续操作：在实验开始前将所有标准品和标本做适当的准备

试剂没有按说明书平衡至室温

在所有试剂加入孔前，确保它们已平衡至室温，除非说明书中有另外的要求。

 是否可更改试剂盒 所提供的实验操

作步骤？

一般厂商为确保zui高的灵敏度和特异性，对试剂盒都进行了优化，为确保每一试剂盒实验的规范性应按说明书操作。

是否可混用不同试剂盒中的试剂？

不允许。绝大多数试剂在每批试剂盒中是特异的，若有问题可与厂家或代理商。

是否可增加或减少标本的体积。

商品化的试剂盒所需加入的标本体积是优化的，应按说明书操作，不建议更改所加标本的体积。

是否可重确定自己的标准曲线的点？

可以。说明书上有建议的制备标准曲线时标准品的稀释度，可改变稀释倍数和增加曲线的点，但是必须在检测范围内，高于试剂盒中zui高标准品的点和低于灵敏度以下的点是无效的。