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上海邦景实业有限公司
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ELISA试剂盒双抗体夹心法操作说明
2022-6-21 阅读(454)
ELISA试剂盒双抗体夹心法是最有用的免疫测定形式之一，它设计用于检测可溶性抗原。根据使用的抗体数量，该ELISA有两种形式。两者的原理是相同的，一种是直接将抗原固定在固相上，另一种是将捕获抗体固定在固相上以捕获抗原。
方法原理:
本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。
这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。我们用在霍乱肠毒素的测定。HbSAg及HbS的测定。ELISA试剂盒双抗体夹心法操作具体过程如下：
1、包被:
用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。
2、加样:
加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3、加酶标抗体:
于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃ 孵育0.5~1小时，洗涤。
4、加底物液显色:
于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10~30分钟。
5、终止反应:
于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6、结果判定:
可于白色背景上，直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以"+"、"-"号表示。也可测OD值:在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
操作注意要点：
1.加样：
要用相同口径的滴管，保持准确的加样姿势，加样时应将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，不可出现气泡。
2.孵育：
孵育的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱。
3.洗涤：
洗涤是决定反应成败的关键，不能忽略此步骤。
4.显色及终止反应：
显色要按照规定的温度和时间操作，用酸终止。
5结果判断：
读结果时，要保证试验板是平整透明的，否则会影响比色结果。
