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详解PCR引物设计原则
2022-7-5 阅读(2450)
PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
PCR 引物设计基本原则：
1）、引物长度：18-26bp，可放宽至18-30bp（有研究表明超过30bp再增加引物长度意义不大）；
2）、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列存在；
3）、引物Tm：54-58℃，可放宽至52～62℃，GC%>60%可进一步放宽；
4）、扩增子Tm：>92℃；
5）、3'端：优选三联体WSS、SWS、TTS，二连体GC，单体S，尽量规避WWW、CGW、GGG、CG；
6)、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有*互补序列，否则易导致非特异性扩增；
7）、末端2bp最好为GC；
8）、引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物su、荧光物质、de高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等；
9）、其他：避免3'端8bp及以上序列与模板多位点互补，尽量避免上下游3'端4bp及以上反向互补，尽量避免内部回文。
基于上述原则，实践中两种应用情况：
1、基因克隆PCR引物设计
这种情况我们往往并没有太多选择，只能从ATG开始，从TAA等结束，什么GC%、二聚体和错配，可能根本由不得我们。既然起点定了，那只能通过改变长度来匹配*优设计要求了。
2、鉴定PCR引物设计
我们只需要确认一段DNA序列上的一部分，起点是相对的，我们可以在整个序列范围内搜索，引物设计的灵活性大大提高，当然搜索时间也要增加。
