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实时荧光定量PCR（RT-qPCR）原理主要步骤
2023-9-25 阅读(211)
实时荧光定量 PCR (RT-qPCR) 是一种用于实时扩增和检测特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物学技术。该方法利用荧光染料或探针，当与扩增的 DNA 或 RNA 分子结合时会发出信号，从而可以对目标序列进行量化。RT-qPCR 通常用于基因表达分析、病毒载量定量和基因突变检测等应用。
RT-qPCR原理的反转录、PCR扩增及荧光实时检测三个主要步骤：
1、反转录：
使用逆转录酶和特定引物将RNA样品反转录成cDNA。
该步骤将RNA模板转化为更稳定且可扩增的DNA形式。
反转录过程中使用特定引物。
2、PCR扩增：
使用特定引物对cDNA进行PCR扩增，这些引物环绕目标区域。
PCR是一个循环过程，呈指数级扩增DNA模板的数量。
PCR反应中包含荧光染料或探针，它们结合到扩增的DNA序列上并发出荧光信号。
3、荧光实时检测：
使用实时PCR仪器实时监测荧光信号。
荧光的数量与每个PCR循环中扩增的DNA数量成比例。
使用专业软件分析数据以确定循环阈值（Ct）值，该值表示荧光信号达到特定阈值水平所需的循环数。Ct值用于计算原始样品中存在的目标DNA量，从而允许进行基因表达或病毒载量等定量分析。
