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PCR反应循环步骤介绍
2023-12-18 阅读(287)
PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。它利用DNA聚合酶在模板DNA上的反复扩增（涉及到三个步骤：变性、退火和延伸）来实现短时间内产生大量特定的DNA序列。PCR技术已经被广泛用于基因检测、病毒检测、DNA测序等领域。
在变性步骤中，模板DNA被加热以使其变性，即将其双链DNA分离成两条单链DNA。在退火步骤中，引物与模板DNA结合形成一个双链DNA结构。在延伸步骤中，聚合酶沿着模板DNA链合成新的单链DNA，从而扩增特定的DNA片段。
PCR需要经过以下循环：
1.初始化步骤。这仅对热启动 PCR 不可少。此步骤将溶液加热至 94-98°C，以激活 DNA 聚合酶。该步骤的时间取决于所使用的聚合酶。
2.变性步骤。DNA是双链分子，DNA扩增需要引物与单链DNA模板相互作用。在此步骤中，将反应混合物加热至 94-98°C 并保持 20-30 秒，以破坏两条链之间的氢键并生成单链 DNA 分子。此时进入 PCR 循环。
3.退火步骤。变性后，反应混合物中的 DNA 模板是单链的。由于引物与DNA模板互补，当反应温度降低到50-65℃时，引物会与模板序列匹配，互补碱基之间形成氢键。退火温度取决于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。该步骤将持续约 20-40 秒以全退火，然后聚合酶将定位到引物-模板杂交体以开始 DNA 组装。
4.伸长步骤。在此步骤中，DNA 聚合酶开始合成 DNA，因此温度应为 DNA 聚合酶的最适温度。一般选择 72°C，但有些酶在 68°C 时效果更好。这一步与体内DNA复制非常相似，DNA聚合酶将dNTPs添加到引物中，以5'到3'方向与模板互补，最终产生新的双链DNA片段。延伸时间取决于目标 DNA 片段的长度和 DNA 聚合酶的能力。一般来说，DNA 聚合酶每 60 秒产生一千个碱基。
