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上海邦景实业有限公司
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免疫荧光技术(IF)主要操作步骤
2024-3-4 阅读(77)
免疫荧光技术（Immunofluorescence，IF）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术发展最早的一种，它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，通过将抗体与一些示踪物质结合，它利用抗原抗体特异性结合的原理先将已知抗体标上英光素以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光从而可确定组织中某种抗原的定位进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便所以在临床病理诊断、检验中应用较广。
免疫荧光技术主要步骤:
1、冰冻切片制备:建议用新鲜组织否则组织细胞内部结构破坏易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等防止裂片和脱片。
2、组织切片固定切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min,尤其要较长时间保存的白片,一定要及时固定和适当保存。
3、血清封闭:为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合需要在一抗孵音前先用血清(与二抗来源一致)封闭减弱背暴着色，血清封闭的时间是可以调整的一般10-30min。
4、一抗孵音条件在免疫组化反应中最重要包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵查温度有几种4度、室温。
37度其中4度效果更佳孵音时间这与温度、抗体浓度有关一般37度1-2h4度过夜(从冰箱拿出后37度复温45min)。具体条件还要摸索。
5、二抗孵育条件一般室温或37度30min-1h具体时间需要摸索而浓度一般有工作液若是浓缩液还要摸索浓度一定要避光反应，但在免疫荧光中我们一般先把三抗浓度和孵育时间先定下然后去摸索一抗浓度和邦育时间。最后荧光素标记的二抗随着保存时间的延长可能会有大星的游商荧光素残留需要注意配制时小包装和并进行适当的商心。
6、复染目的是形成细胞轮廊从而更好地对目标蛋白进行定位，一般常用DAPI复染。
7、封片:为了长期保存我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角,接近封片液近端的拐角先降低直至接触到液体时为止当发现液体接触面在不断弥散时则可以缓慢降低另一拐角这样一般不会产生气泡。
8、切片清洗:为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次而一抗孵育后的清洗均为5次*5min.
注意事项:
(1)单独冲洗,防止交叉反应造成污染。
(2)温柔冲洗,防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式。
(3)冲洗的时间要足够,才能全洗去结合的物质。
(4)PBS的PH和离子强度的使用和要求(建议PH在7.4-7.6,浓度是0.01M;中性及弱碱性条件有利于免疫复合物的形成,而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成,而高离子强度则有利于分解。
9、拍照有条件的话更好立即拍照若不能及时拍照也要封好片和用指甲油封固,保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作不要随意改变程序应在暗室中进行检查防止紫外线对眼睛的摄害在调救光源时应戴上防护眼镜检查时间每次以1~2h为宜超过90min.超高压录灯发光强度逐渐下降荧光减弱标本受紫外线照射3~5min后荧光也明显减弱或褪色激发光长时间的照射,会发生荧光的衰减和淬灭现象:所以最多不得超过2~3h荧光显微镜光源寿命有限标本应集中检查，以节省时间,保护光源。天热时应加电扇散热降温新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时须待灯光充分冷却后才能点燃。中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后标本染色后立即观察因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚之烯塑料袋中4℃保存可延缓荧光减弱时间,防止封裱剂蒸发,使用的玻片等载体都必须厚度均匀无明显的自发荧光如果使用油镜还必须保证镜油为无荧光镜油电源更好装稳压器,否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命也会影响镜检的效果。
