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上海邦景实业有限公司
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PCRR实验一般循环步骤
2024-12-23 阅读(198)
PCR由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成。
准备好各种试剂和PCR仪，就可以开始PCR实验：将各种试剂混合并按照说明书设置PCR反应。一般PCR循环如下：
1、起始步骤：这对于热启动PCR而言是必须的，将反应混合液加热至94~98℃以激活DNA聚合酶。这一步的时间取决于所选用的DNA聚合酶。
2、变性步骤：DNA本身是双链结构，而DNA扩增需要引物与单链DNA模板相结合。在这一步，反应混合液被加热至94～98℃保持20～30秒以破坏双链间的氢键以便释放出单链DNA。这是PCR循环中的第一步。
3、退火步骤：变性之后，DNA模板以单链的形式在反应混合液中存在。因为反应体系中的引物与DNA模板互补，当反应温度降至50~65℃时，引物与互补的序列形成氢键。退火温度主要取决于引物的Tm值，通常比引物Tm值低3～5℃。这一步通常维持20～40秒，而聚合酶会结合至引物-模板双链处开始DNA合成。
4、延伸步骤：在这一步，DNA聚合酶开始DNA合成，因此这一步的温度选取的是DNA聚合酶的优温度。通常我们选用72℃，但某些DNA聚合酶的最适温度是68℃。这一步与体内的DNA复制很相似：DNA聚合酶按照碱基互补规律将dNTPs加到引物的3’末端最终得到新的DNA双链片段。延伸时间取决于目的DNA片段的长度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能够合成1kb长度的DNA。
5、循环：第2步至第4步称为一个循环。每次循环之后DNA的量均是前一次的两倍。通常一次PCR反应进行30~35个循环。在前几轮的PCR循环过程中PCR产物的量以指数速率增长，但是到了反应后期随着dNTPs和引物的量的减少以及DNA聚合酶的失活，反应速率逐渐下降，因此PCR反应的产量也受到了限制。
6、最后的延伸步骤：当30~35个循环结束后，我们通常会以68~74℃延伸5~10分钟，这是希望使反应体系中残留的单链DNA全部反应完毕。
7、保存温度：通常我们设置4~10℃为反应后PCR产物的保存温度。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
