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上海邦景实业有限公司
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PCR使用的Taq酶应该注意如下问题
2020-2-27 阅读(3538)
为弥补taq酶这一缺点常将克隆后的序列进行测序，来确认所扩增序列的准确性。同时也可采用保真度更高的Pfu DNAPolymerase，来确保扩增的准确性，Pfu DNAPolymerase有3 ’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性，是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率Z低的。但PCR产物为平端，不能进行Ta克隆！而解决此问题的办法是使用TaqPlus DNAPolymerase，该酶是Taq 酶和pfu Polymerase的混合物，因此既能保证准确性又能保证能够进行Ta克隆。在使用中应该注意如下问题：
1．25ul体系中一般用量为0.1ul（用枪头沾一下即可），用量过多可能会出现非特异性扩增。
2.PCR体系构建过程中Z后加入的一种成分，因此只有在其他试剂加完之后才可从冰箱中取出加入。
3.Taq酶中含有甘油，故不结冰，若结冰则应丢弃。
4.对于预变性时间较长的PCR反应，应在预变性即将结束后加入酶，减少长时间高温对酶活力造成的损伤。
5.保存时间过长的酶可以适当增加用量。
PCR使用的taq酶在反应时由于丧失3’——>5’外切核酸酶活性，因而不具有校正活性。在典型的一次PCR反应中，taq酶造成的错误的核苷酸错误的掺入率大概为每20000个核苷酸中就有一个，虽然表面上看起来不会有多大的影响，但是在分子克隆中如果有一个错误核苷酸掺入，很有可能造成移码突变，影响是严重的
