钙黄绿素AM是流行的荧光探针之一，用于标记和检测活细胞的细胞功能。但是，钙黄绿素AM的单色使得无法在多色应用中使用这种有价值的试剂。例如，由于与GFP相同的颜色，不可能在结合GFP的细胞中使用钙黄绿素AM。为了解决钙黄绿素AM的颜色限制，我们开发了钙黄绿橙，钙黄绿和钙黄绿。这些新的Calcein AM类似物与Calcein AM结合使用，可以对活细胞进行多色标记和功能分析。非荧光钙黄绿素 AM可以轻松进入活细胞并水解产生强荧光钙黄绿素染料。可以使用通用的TRITC / Cy3滤波片组检测Calcein Red 染料。

3.百萤 钙黄绿素红钠盐实验方案

AM酯是非极性酯，很容易穿过活细胞膜，并被活细胞内的细胞酯酶迅速水解。AM酯被广泛用于无创地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。但是，使用AM酯时必须特别注意，因为它们易于水解，特别是在溶液中。在使用高质量无水二甲基亚砜（DMSO）之前，应将其重新配制。DMSO储备溶液可在-20°C的环境中干燥保存，并避光。在这些条件下，AM酯应稳定数月。

以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。该协议仅提供指南，应根据您的特定需求进行修改。

1）.准备2至5 mM的AM酯高品质无水DMSO储备溶液。非离子型洗涤剂F-127有时用于增加AM酯的水溶性。

注：20％的Pluronic等体积® F-127溶液可以稀释到装载缓冲器之前加入到细胞活力指标DMSO储备溶液。终的Pluronic ® F-127的浓度为约0.02％。

2）.在实验当天，将细胞活力的固体指示剂溶解在DMSO中，或将指示剂储备溶液的等分试样解冻至室温。在您选择的缓冲液（例如Hanks和Hepes缓冲液）中准备1至10 µM的工作溶液。对于大多数细胞系，建议终浓度为4至5 µM的细胞活力指标。必须根据经验确定细胞加载所需指示剂的确切浓度。

3）.如果您的细胞中含有有机阴离子转运蛋白，则可将*磺舒（1-2.5 mM）或亚砜并吡嗪（0.1-0.25 mM）添加到细胞培养基中，以减少去酯化指示剂的泄漏。在室温或37°C下将细胞与AM酯孵育20分钟至一小时。

注意：降低装载温度可能会减少指示器的分隔。

4）.在无细胞活力指示剂的缓冲液（如果适用，包含阴离子转运蛋白抑制剂）中洗涤细胞，以去除多余的探针。

注意：立即通过流式细胞仪分析细胞样品，以测定零时每个细胞的平均荧光强度，无需清洗。

5）.在所需的Ex / Em波长下运行实验。

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