3. 检查 PE的纯度和浓度，请测量280、565 和 6 2 0 nm 处的吸光度。 (1mg/ml 的 PE 在 565nm 处的 OD 为 8 . 2 ) 。 5 6 5 / 6 2 0 比率 > 5 0 表示已充分去除污染的藻蓝蛋白；565/280 比率 > 5 表示已充分去除所有其他蛋白质。

二 .P E 的活化

1.使用前在无水 DMSO 中制备 10 mg/ml 的 SMCC 储备溶液。

2.每毫克 PE 加入 1 1 μlSMCC, 并进行涡旋。将反应管用铝箔包好，室温下旋转60 分钟。

3.将纯化的 PE 过凝胶过滤柱来交换缓冲液。

注意：对于失败或效果较差的结合，增加或减少 SMCC 相对于 PE 的量，可能会有所好转。

三 . 1gG 还 原

1.在蒸馏水中制备 1 M DTT(15.4mg/100 μl) 的新鲜溶液。

2.1gG 溶液浓度应为 4 mg/ml 或更高，这样效果比较好。还原几乎可以在任何缓冲液中进行； MES 、磷酸盐和 TRIS 缓冲液 (pH 范围为 6 至8)已被验证可以使用。如果抗体浓度低于

2 mg/ml, 则应浓缩。缓冲液交换柱上的损失应额外增加10%。

3.用 DTT 配制 20 mMlgG 溶液：每毫升 IgG 溶液加入 20μ lDTT 原液并搅拌。室温下静置30分钟，无需额外搅拌 (以尽量减少半胱an酸再氧化为胱an酸)。

4.将还原的lgG 通过预平衡的“交换缓冲液"过滤柱。收集0.25毫升的级分，测定蛋白浓度，并将含有大部分lgG 的级分汇集在一起。可以通过分光光度法或比色法完成。

5.此步骤后尽快进行缀合。

注意：对于结合较差或失败的情况，降低 DTT 浓度可能会有所帮助。

四 .进行缀合

1.每毫克 IgG 添加 3.2 毫克 SMCC-PE。用铝箔包裹反应管并在室温下旋转60 分钟。注意：这些摩尔比 ( 每 IgG 约 2 个 PE) 效果很好。对于失败或效果不佳的结合，不同的摩尔比可能会有所帮助。

2.60 分钟后，必须去掉 lgG 上未反应的游离巯基。

3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制备 10 mg NEM 的新鲜溶液。

4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。室温下包裹并旋转20 分钟。

2.60 分钟后，必须去掉 lgG 上未反应的游离巯基。

3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制备 10 mg NEM 的新鲜溶液。

4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。室温下包裹并旋转20 分钟。

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