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上海沪宇和您一起学习核酸的相关性质

阅读:393发布时间:2012-4-25

核酸的性质(包括化学、物理、以及光谱学和热力学):

 

  a.化学:

 

  ① 酸效应:在强酸和高温,核酸*水解为碱基,核糖或脱氧核糖和磷酸。在浓度略稀的的无机酸中,zui易水解的化学键被选择性的断裂,一般为连接嘌呤和核糖的糖苷键,从而产生脱嘌呤核酸。

 

  ②碱效应

 

  1. DNA:当PH值超出生理范围(pH7~8)时,对DNA结构将产生更为微妙的影响。碱效应使碱基的互变异构态发生变化。这种变化影响到特定碱基间的氢键作用,结果导致DNA双链的解离,称为DNA的变性

 

  2. RNA:PH较高时,同样的变性发生在RNA的螺旋区域中,但通常被RNA的碱性水解所掩盖。这是因为RNA存在的2`-OH参与到对磷酸脂键中磷酸分子的分子内攻击,从而导致RNA的断裂。

 

  ③化学变性:一些化学物质能够使DNA/RNA在中性PH下变性。由堆积的疏水剪辑形成的核酸二级结构在能量上的稳定性被削弱,则核酸变性。

 

  b.物理:

 

  ④黏性:DNA的高轴比等性质使得其水溶液具有高黏性,很长的DNA分子又易于被机械力或超声波损伤,同时黏度下降。

 

  ⑤ 浮力密度:可根据DNA的密度对其进行纯化和分析。在高浓度分子质量的盐溶液(CsCl)中,DNA具有与溶液大致相同的密度,将溶液高速离心,则CsCl趋于沉降于底部,从而建立密度梯度,而DNAzui终沉降于其浮力密度相应的位置,形成狭带,这种技术成为平衡密度梯度离心或等密度梯度离心

 

  c.光谱学:

 

  ⑥减色性:dsDNA相对于ssDNA是减色的,而ssDNA相对于dsDNA是增色的。

 

  ⑦ DNA纯度:A260/A280。

 

  d.热力学:

 

  ⑧热变性:dsDNA与RNA的热力学表现不同,随着温度的升高RNA中双链部分的碱基堆积会逐渐地减少,其吸光性值也逐渐地,不规则地增大。较短的碱基配对区域具有更高的热力学活性,因而与较长的区域相比变性快。而dsDNA热变性是一个协同过程。分子末端以及内部更为活跃的富含A-T的区域的变性将会使其赴京的螺旋变得不稳定,从而导致整个分子结构在解链温度下共同变性。

 

  ⑨ 复性:DNA的热变性可通过冷却溶液的方法复原。不同核酸链之间的互补部分的复性称为杂交。

 

  一、核酸的大小和测定

 

  一般来说,进化程度高的生物DNA分子应越大,能贮存更多遗传信息。但进化的复杂程度与DNA大小并不*一致,如哺乳类动物DNA约为3×109 bp,但有些两栖类动物、南美肺鱼DNA大小可达1010bp到1011bp。

 

  常用测定DNA分子大小的方法有电泳法、离心法。凝胶电泳是当前研究核酸的zui常用方法,凝胶电泳有琼脂糖(agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰胺(polyacrylamide)凝胶电泳。

 

  二、核酸的水解

 

  DNA和RNA中的糖苷键与磷酸酯键都能用化学法和酶法水解。在很低pH条件下DNA和RNA都会发生磷酸二酯键水解。并且碱基和核糖之间的糖苷键更易被水解,其中嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定。在高pH时,RNA的磷酸酯键易被水解,而DNA的磷酸酯键不易被水解。

 

  水解核酸的酶有很多种,若按底物专一性分类,作用于RNA的称为核糖核酸酶(ribonuclease,RNase),作用于DNA的则称为脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease,DNase)。按对底物作用方式分类,可分核酸内切酶(endonuclease)与核酸外切酶(exonuclease)。核酸内切酶的作用是在多核苷酸内部的3’,5’磷酸二酯键,有些内切酶能识别DNA双链上特异序列并水解有关的3’,5’磷酸二酯键。核酸内切酶是非常重要的工具酶,在基因工程中有广泛用途。而核酸外切酶只对核酸末端的3’,5’磷酸二酯键有作用,将核苷酸一个一个切下,可分为5’→3’外切酶,与3’→5’外切酶。

 

  三、核酸的变性、复性和杂交

 

  (一)变性

 

  在一定理化因素作用下,核酸双螺旋等空间结构中碱基之间的氢键断裂,变成单链的现象称为变性(denaturation)。引起核酸变性的常见理化因素有加热、酸、碱、尿素和甲酰胺等。在变性过程中,核酸的空间构象被破坏,理化性质发生改变。由于双螺旋分子内部的碱基暴露,其A260值会大大增加。A260值的增加与解链程度有一定比例关系,这种关系称为增色效应(hyperchromic effect)。如果缓慢加热DNA溶液,并在不同温度测定其A260值,可得到“S”形DNA熔化曲线(melting curve)。从DNA熔化曲线可见DNA变性作用是在一个相当窄的温度内完成的。

 

  当A260值开始上升前DNA是双螺旋结构,在上升区域分子中的部分碱基对开始断裂,其数值随温度的升高而增加,在上部平坦的初始部分尚有少量碱基对使两条链还结合在一起,这种状态一直维持到临界温度,此时DNA分子zui后一个碱基对断开,两条互补链*分离。通常把加热变性时DNA溶液A260升高达到zui大值一半时的温度称为该DNA的熔解温度(melting temperature Tm),Tm是研究核酸变性很有用的参数。Tm一般在85~95℃之间,Tm值与DNA分子中G C含量成正比。

 

  (二)复性

 

  变性DNA在适当条件下,可使两条分开的单链重新形成双螺旋DNA的过程称为复性(renaturation)。当热变性的DNA经缓慢冷却后复性称为退火(annealing)。DNA复性是非常复杂的过程,影响DNA复性速度的因素很多:DNA浓度高,复性快;DNA分子大复性慢;高温会使DNA变性,而温度过低可使误配对不能分离等等。*的复性温度为Tm减去25℃,一般在60℃左右。离子强度一般在0.4mol/L以上。


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