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上海泛柯实业有限公司
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阅读:389发布时间:2012-8-27
神经退行性疾病(neurodegenerativedisorder)是由于神经元进行性变性死亡导致的以中枢神经系统损害为主的神经系统疾病.其中包括帕金森病、阿尔茨海默症、亨廷顿舞蹈病等.当错误折叠的蛋白超过分子伴侣的重新折叠和泛素-蛋白酶体系降解能力的时候,错误折叠的蛋白质可以通过被介导的动力蛋白马达逆向转运至微管组织中心周围形成蛋白聚集体.蛋白聚集体的形成被认为是细胞的一种防御反应,隔离有毒的错误折叠蛋白进而进行清除.蛋白聚集体通路的研究可为多种神经退变性疾病提供治疗靶点.
蛋白聚集严重影响以蛋白为基础研发的药物。在药物制剂中,蛋白聚集在生物活性和免疫原性方面影响药效。
蛋白聚集发生在生产过程的各个阶段包括细胞培养、纯化、生产、储存、运输等方面。制药工业希望在生物工艺中找到新的方法,可用于检测、追踪、定量分析影响蛋白聚集的因素。
近年来以冻干稳定形式存在的蛋白聚集体作为标准品,可以准确地定量检测蛋白聚集,加上新颖的只需在酶标仪里即可实验的ProteoStat®proteinaggregationassay,可对蛋白检测方法进行优化。
在96孔微板中检测比较ProteoStat和ThioflavinT染料与蛋白聚集的结合能力。纯化的兔抗羊lgG(4.26mg/ml)在pH2.7的盐酸水溶液中,80℃温度下孵育90分钟后会形成蛋白聚集体。
聚集信号由聚合体和单体混合比例不同决定的,但总的lgG蛋白浓度仍然是60ug/ml。在50mM磷酸钾,pH7,3uMProteoStat检测试剂或5uMThioflavinT染料中读数。这些浓度在以前做过预实验,已经确定是*的浓度。
在蛋白和染料一起孵育15分钟后使用BioTekSynergyMxMicroplateReader读数。所用的板为GreinerµClear®black,clearbottom96-wellmicroplates(GreinerBioOne)。
在相同情况下,ProtesStat染料的荧光强度比ThioflavinT染料高100倍。对于浓度为1.2ug/ml的聚集体,ProteoStat染料的信噪比为12.8,而ThioflavinT染料的信噪比仅为1.2,表明ProteoStat染料在蛋白聚集检测中更准确、灵敏度更高。
正因为由此显著的优势,ProteoStatproteinaggregationassay和ProteoStatproteinaggregationstandards通常能够共同用于各种常规形式的蛋白聚集检测。
在刚开始阶段蛋白聚集情况较少,接着观察到生长阶段聚集体开始形成,zui后生长率降低直至变成0,表明蛋白单体已几乎消失,差不多*形成聚集体。
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