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ELISA试剂操作中出现的问题有哪些?

时间:2012-12-7阅读:800
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问题

可能原因

防止方法

(一)
显色淡
灵敏度偏低

1.试剂盒在运输途中时间太长,温度太高

试剂盒置保温箱内运输,并放足够数量的冰块,尽量缩短运输时间

2.试剂盒超过有效期

超过效期试剂盒不要使用

3.试剂、样品用前未能平衡

用前试剂、样品置室温平衡 30分钟左右

4.试剂开启时间过长长菌

试剂开启后请尽量在短时间内用完

5.移液器吸量不足,移液抽吸排放太快,吸头内壁挂液太多或内壁不清洁

校正移液器,吸头要配套,每次装吸头要吻合紧密。移液不宜过快,排放应*。吸头内壁要清洁,一次性使用。

6.恒温箱温度不足37℃或水浴锅水温度不足37℃)

放入反应板时注意培养箱温度,及时调整,孵育反应期间开启不宜太多,影响温度平衡。

7.孵育反应时间不足

定时钟准确定时

8.洗涤时冲击力太大,洗涤液浸泡时间太长,洗涤次数增加

减少洗涤冲击力,按说明书要求保留洗涤时间,准确记住洗涤次数

9.显色剂滴加量不足或顺序颠倒,或混合后加入

滴加显色液时,滴瓶垂直向下,持力均匀,滴速不宜过快,先加显色剂 A,反加显色剂B,不可将A、B液混合后加入

10.显色剂反应时间不足

准确定时

11.蒸馏水水质有问题

测定蒸馏水配制试剂对酶免疫法的影响

12.样品和NaN 3 防腐,抑制了酶的反应

样品不能加 NaN 3 防腐

(二)
重复性差

1.对于定量产品,没带标准品、质控品,采用以前的标准线

每次试验都必须带标准品、质控品

2.样品数量多少不一,加样时间有长有短

重复某一样品时,加样时间尽可能与*次接近

3.样本加入后未混匀

加样后在混匀器上充分混匀

4.移液器加样量不一致

尽可能使用同一移液器和装紧吸头移液时用力及抽吸速度一致

5.酶标仪滤光片不对或输入波长不对

TMB显色用450或450/630nm双波长

6.酶标仪测定重复性差

校准酶标仪

7.操作过程个别孔液体外溅

稳拿稳放,防止外溅

8.不同批号试剂盒中组分混淆

不同批号试剂,不能混用

9.瓶盖相互交叉使用

不同组分瓶盖间不能交叉使用

10.献血员冒名顶替

严格管理献血员

11.保温时间不一致

重复测定标本,反应条件、人员等尽可能与上次保持一致,以排除这些因素造成不一致的可能性,计时应以*滴 TMB的B液加入开始计时

12.洗涤条件不一致

13.显色条件时间不一致

14.操作人员不一致

15.洗涤不正确

用洗液注满各孔,但不要溢出。甩板时反应板面向下,垂直用力甩净内容物(可多甩几次),在干净、无或少尘的吸水材料上拍干。洗板机洗板时不应有堵孔,洗涤应充分

16.温育条件不一致(一次用水浴,一次用恒温箱)

恒温箱温育较水浴显色深, OD值高出0.10-0.15,均采用恒温箱,没有恒温箱者,水浴锅的水温应控制在37℃

17.唾液或其它杂物掉入孔内

用记号笔直圈上,便于分析

18.不慎加酶或底物液于孔壁上,有残留

用吸水纸吸干壁上残留的酶或底物液

19.不慎多加或少加酶或显色剂B

多加时显色深,少加则浅,用记号笔圈上,便于分析

20.阈值附近时阴时阳

重复做奇数次,以偶数次结果为准

21.标本离心处理不全,致使检测时于反应板孔内发生凝血现象或残留细胞成分干扰

血清或血浆应充分离心处理, 3000rpm6分钟以上

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