牛牛天天人人综合影院 3-磷酸甘油酸激酶试剂盒说明书

【资料简介】

3-磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase，PGK） 试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。
3-磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase，PGK） 试剂盒说明书 测定意义
3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，广泛存在于动植物和微生物体内，催化 1，3-二磷酸
甘油酸转变为 3-磷酸甘油酸，产生1分子 ATP，具有影响 DNA复制和修补及刺激病毒RNA
合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。
测定原理
3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和 ATP产生 1,3-二磷酸甘油酸和 ADP， 1,3-二磷酸甘油
酸在 3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH 作用下产生3-磷酸甘油醛、NAD和磷酸，340nm处的吸
光度变化反映了 3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。
自备实验用品及仪器
天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计、1 mL石英比色皿。
3-磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase，PGK） 试剂盒说明书 试剂组成和配制
提取液：液体100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 25mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加 5mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后
-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂三：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加 2.5 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装
后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂四：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加 2.5 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装
后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂五：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 10 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装
后-20℃保存，禁止反复冻融。
酶液提取
①总 PGK酶提取：建议称取约 0.1g样本，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，
200W，破碎3s，间歇7s，总时间 1min） ，然后 4℃，500g离心 5min，取上清测定。
②胞浆和叶绿体 PGK 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5～10 的
比例（建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液），冰浴匀浆后于 4℃，500g 离心 5min，弃
沉淀，取上清在4℃，8000g离心 10min，取上清用于测定胞浆 PGK酶活性，取沉淀加1mL
提取液，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇7s，总时间1min） ，然后 4℃，
500g离心 5min，取上清测定叶绿体中 PGK酶活性。
建议测定总PGK酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的PGK，
则按照步骤②提取粗酶液。
测定操作
1.  分光光度计预热 30min，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2.  取 1mL石英比色皿，依次加入 500μL试剂一，100μL试剂二，50μL试剂三，50μL试剂
四，200μL试剂五，100μL粗酶液，充分混匀，记录340nm处 10s的吸光值 A1和 310s
的吸光值 A2，△A=A1-A2

3-磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase，PGK） 试剂盒说明书 计算公式
（1）按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PGK（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PGK（nmol/min /g  鲜重）＝ΔA÷（ε×d）×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T=321.54×ΔA÷W
V反总：反应体系总体积，1mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103
 L / mol /cm；d：比色
皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时
间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g