男女呻吟久久免费视频 鳅超科鱼类ND4和ND5基因序列分析及其系统发育意义

【资料简介】

1. *水生生物研究所430072；2.华中农业大学430070

摘要：ND4和ND5是线粒体基因组中编码NADH脱氢酶亚基4和亚基5的两个蛋白质编码基因。本研究以鳅超科鱼类为研究对象，新测定了10个物种的ND4和ND5基因全序列，结合从GenBank下载的15个物种的15条序列进行分析。结果显示：鳅超科鱼类ND4基因全长1380～1387bp，以ATG为起始密码子，终止密码子为不*终止信号；ND5基因全长1821～1839bp，同样起始密码子为ATG，终止密码子为TAA或TAG；ND4和ND5基因之间插入了3个tRNA基因，分别编码携带*、*、*的tRNA。ND4和ND5基因（包含3个tRNA基因）中A、T、G、C的平均含量分别为30.4%、27.3%、14.2%、28.1%，A+T （57.7%） 的含量高于G+C （42.3%） 的含量。转换与颠换比（Ts/Tv）平均值为1.586。选取斑马鱼和鲤鱼作为外类群，采用zui大简约法（MP）、zui大似然法（ML）和贝叶斯推断法（BI）进行系统发育树的重建。三种方法的系统发育分析结果都显示：花鳅亚科、条鳅亚科、沙鳅亚科、平鳍鳅科及Vaillanlidae分别构成单系；它们的系统发育关系为：（（（（条鳅亚科+平鳍鳅科）+花鳅亚科）+沙鳅亚科）+Vaillanlidae）。这与线粒体全基因组和某些核基因（如RAG1基因）的研究结果类似，且支持率较高，表明ND4和ND5基因用于鳅超科鱼类的系统发育分析是可行的。但是本研究的结果有别于其它线粒体基因的分析结果，如基于cyt b和Dloop基因进行的系统发育分析认为条鳅亚科和花鳅亚科聚为姐妹群，再和平鳍鳅科聚在一起。这种差异可能是由于线粒体基因的信息量差异造成的，信息量越大，所反映的系统发育结果可能更加接近真实情况。

关键词：鳅超科 ND4ND5基因 序列分析 系统发育

鳅超科（Cobitoidea）隶属于鲤形目（Cypriniformes）。鲤形目是世界上zui大的淡水鱼类类群，约有3268种（Nelson,2006），在经济发展和科学研究中占有很重要的地位。传统的鲤形目鱼类研究多以形态特征为基础，其分类及系统发育关系还存在较多争议，为此，美国自然科学基金资助了 “鲤形目生命树（Cypriniformes Tree of Life, CToL）”的合作项目，希望联合世界各国的鱼类学研究者通过综合鱼类化石、形态特征及分子等各个方面的数据资料对鲤形目鱼类的系统发育问题进行全面的研究。

鳅超科是鲤形目中较为重要的一个类群，其物种数约占整个鲤形目的26％（Nelson,2006）。到目前为止，鳅超科的分类及系统发育关系还未澄清。关于鳅超科的分类，Sawada（1982）根据48个种及亚种的52个骨骼及外部性状特征，把鳅超科分为鳅科（Cobtidae）和平鳍鳅科（Balitoridae）两个科，其中鳅科包括沙鳅亚科（Botiinae）和花鳅亚科（Cobitinae），平鳍鳅科科包括条鳅亚科（Nemacheilinae）和平鳍鳅亚科（Balitorinae）。而国内学者则大多数将条鳅亚科归为鳅科（陈景星， 1995 ；及各地方鱼类志等）。目前上广为接受的是Sawada（1982）的观点（Nelson, 2006；Saitoh等2006）。后来的研究者将以上四个亚科分别提升到科的水平，但在系统发育关系上还存在争议（Nalbant和Bianco,1998; Saitoh等2006；Tang等，2006；Šlechtová等2007）。

20世纪80年代后期以来，分子生物学技术在生物学各个领域中的迅猛发展，使分子数据更广泛应用于鱼类系统发育研究并发挥着重要作用。DNA序列包含极为丰富的系统发育信息，而且随着PCR、DNA序列测定技术的发展使大量DNA序列的获得趋于快捷、准确，相应构树方法的不断改进，也使得使用大量的分子性状构建系统发育树成为现实。线粒体是真核细胞内的重要细胞器，是能量产生与转换的场所，还参与脂肪酸的合成及少量蛋白质的合成。ND4和ND5是线粒体基因组中编码NADH脱氢酶亚基4和亚基5的两个蛋白质编码基因。ND4、ND5基因有相对较快的进化速率，比较适合系统发育关系的重建（Zardoya和Meyer,1996）。

就同一研究类群而言，与短片段序列数据集相比，长片段序列数据集具有更多的数据信息，能够构建出更可靠的系统发育树 （ 参考文献 ） 。线粒体ND4、ND5基因及两个基因间的3个tRNA基因的联合序列（以ND4+5来表示）与应用广泛的cyt b基因相比，具有更多的核苷酸位点，信息量大很多。因此，本研究采用ND4+5基因序列为分子标记，结合从GenBank数据库获得的其它15种鳅超科鱼类的同源序列，以斑马鱼（Daniorerio ）和鲤鱼（Cyprinuscarpio ）作外类群，重建鳅超科鱼类的分子系统树。

1 材料与方法

1.1 研究用标本 DNA测序分析采用的样品均为95%的酒精固定标本，主要从国内各水系收集获得，标本保存于*水生生物研究所淡水鱼类博物馆。具体种类及其它详细信息见表1。

1.2 基因组DNA的提取  在本研究中，采用了两种提取DNA的方法，一种为常规的酚-氯仿抽提法，另一种为高盐抽提法。方法如下。

酚-氯仿抽提法，取鱼背部肌肉适量于1.5mL的Eppendorf管中，用蒸馏水、TE（10mmol/L Tris.HCl，1mmol/L EDTA，pH=8.0）缓冲液浸泡，直到组织中无酒精味。然后加入620μL的SET（0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris.HCl，1mmol/L EDTA，pH=8.0）细胞裂解液，70μL10%的SDS，10μL蛋白酶K（10μg/μL），置于55℃的恒温箱中消化至透明。加入等体积的平衡酚抽提两次，再加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1）抽提，至无蛋白质。加入上清液两倍体积的无水乙醇沉淀2h以上，离心后再用75%的乙醇洗涤沉淀，再离心去乙醇干燥后加入30-50μL的灭菌双蒸水或TE缓冲液溶解，并存于-20℃的冰箱中备用。

高盐抽提法，取鱼背部肌肉适量于2mL的Eppendorf管中，剪碎烘干，加入500μL HOM Buffer和10～15μL蛋白酶K，置于55℃的恒温箱中消化至透明。加入500μL NaCl（4.5mol），300μL氯仿离心。加入600μL异丙醇沉淀，于-20℃保存1h以上，离心后再用70%乙醇洗涤，干燥后加入50μL灭菌双蒸水溶解，同样存于-20℃的冰箱中备用。

1.3 PCR 扩增 ND4+5基因序列全长3387～3443bp。在mtDNA上，ND4基因左侧是ND4L基因，ND5基因右侧是ND6基因，ND4和ND5基因之间是3个tRNA基因。基于此结构，分别在ND4L、ND6基因的侧翼区及ND4、ND5基因内部设计引物。用于扩增的引物共5对：LArgd1+H11618d；L11427dA+H12632dB；L12328d+H13393d；L13058d+H13721d；L13559d+H14710d。

PCR反应的总体积为60μL，反应体系包括：10×Buffer 6μL，dNTPs 1.2μL（每个碱基浓度为2.5mmol/L），引物各1.5μL（10pM），Taq酶3.0U。PCR反应条件为：95℃预变性3min，然后循环包括：94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，zui后再72℃延伸5min。

1.4 PCR 产物的纯化和测序 PCR产物用1.0%的琼脂糖电泳检测，并在紫外投射仪上观察。PCR产物用试剂盒进行割胶回收或直接过柱回收。回收产物送上海生工生物公司测序。

1.5 数据分析 DNA序列的排列使用ClustalX软件，并进行手工调整。从GenBank下载鳅超科鱼类和外类群鱼类的ND4＋5基因序列。通过比对分析找出序列的起始密码子（ATG）和终止密码子，删除起始密码子前和终止密码子后的碱基。序列中各碱基的含量及变异情况用Mega4.0中的Statistic命令进行分析。用PAUP^*软件统计出序列中转换和颠换的数目以及序列的变异情况（用GTR模型下的遗传距离，GTR distances），并在Statistica 6.0软件中进行作图分析序列中碱基替代的饱和程度。分子系统树的构建采用zui大简约法（MP）、zui大似然法（ML）和贝叶斯推断法（BI），其中MP和ML法采用为PAUP^*4.0b10（Swofford,2002）软件，BI法采用MrBayesV3.0（Ronquist和Huelsenbeck,2003）软件。

2 结果

2.1 鳅超科鱼类ND4＋5基因序列与遗传变异分析  鳅超科鱼类ND4基因全长1380～1387bp，以ATG为起始密码子，终止密码子为不*终止信号；ND5基因全长1821～1839bp，同样起始密码子为ATG，终止密码子为TAA或TAG；ND4和ND5基因之间插入了3个tRNA基因，分别编码携带*、*、*的tRNA，序列长度分别为70bp、68bp、73bp。ND4＋5基因中A、T、G、C的平均含量分别为30.4%、27.3%、14.2%、28.1%，A+T （57.7%） 的含量高于G+C （42.3%） 的含量。

基于Kimura双参数模型计算遗传距离，以确定类群间的遗传分化程度，结果显示类群间的遗传距离值为0.203～0.255（表2）。鳅超科ND4＋5基因序列转换与颠换之比（Ts/Tv）的变异范围为0.983～9.579，平均值为1.586。在供分析的3462个位点中，共有1899个变异位点，其中简约信息位点为1525个。图1显示所有个体ND4+5基因序列的转换和颠换均未达到饱和，说明序列中的替代均具有系统发育意义，可用于数据分析。在所有的变异水平上，转换数明显大于颠换数。

2.2 分子系统树 基于目前的数据，我们分析了鳅超科鱼类五个不同的类群，条鳅亚科，花鳅亚科，沙鳅亚科，平鳍鳅科和Vaillanlidae。其中Vaillanlidae只包含一个属Vaillanla，该属只分布于印尼及马来西亚一带（fishbase）。使用zui大简约法（MP）、zui大似然法（ML）和贝叶斯推断法（BI）构建分子系统树。三种方法构建的分子系统发育树的拓扑结构基本一致（图2－4）。

以斑马鱼（Danio rerio）和鲤鱼（Cyprinus carpio）作外类群，三种构树方法的结果一致显示，鳅超科的系统发育关系为：（（（条鳅亚科+平鳍鳅科）+花鳅亚科）+沙鳅亚科）+Vaillanlidae）；条鳅亚科、平鳍鳅科、花鳅亚科、沙鳅亚科和Vaillanlidae这五个类群都各自独立形成单系，且都得到较高的支持率（均超过90；见图2-4）；条鳅亚科和爬鳅科的鱼类聚在一起构成一个分支（lineage），均得到较高的支持（MP树中为自展支持率（bootstrap value, BP）为50，ML树中BP为68， BI树中后验概率（posterior probability，PP）为94）。该分支与花鳅亚科构成姐妹群，然后再与沙鳅亚科一起构成一个大的分支群。Vaillanla处于所有鳅类的根部位置，成为一个独立的分支，其支持率较高（MP树中为78，ML树中为76，BI树中为100）。至于每个类群内部物种间的系统发育关系，MP树（图2）、ML树（图3）和BI树（图4）的拓扑结构几乎一致，只在部分样本（花鳅亚科中花鳅属的三个物种及条鳅亚科中的四个物种）的分支顺序存在差异。

平鳍鳅科明显分为两个支系：平鳍鳅亚科和腹吸鳅亚科，它们分别构成单系群。腹吸鳅亚科的支持率在三种方法构建的分子系统发育树中都为100%，平鳍鳅亚科的支持率分别为82%（MP树）、68%（ML树）和98%（BI树）。花鳅亚科中，花鳅属（Cobitis）和泥鳅属（Misgurnus）的物种都能分别构成单系,且支持率很高（见图2-4）。由图可知，ML树和BI树中花鳅属的聚类情况跟MP树中花鳅属的聚类情况有所不同。本研究的样本包含沙鳅亚科中的两个属：沙鳅属（Botia）和薄鳅属（Leptobotia）（陈景星，1980；Nelson，1994；唐琼英等，2008），在三种树中各自构成单系。

3 讨论

3.1 ND4 和ND5基因的特点及在系统发育分析中的应用  mtDNA不同区段基因序列的进化速度不一样（李耀东和邵嘉会，2006）。因此，选取mtDNA上的不同基因或片段序列，可以进行不同分类水平上的进化研究。对于亲缘关系较远的物种，一般选取选择压力大、比较保守的基因序列；对于亲缘关系较近的物种，则选取选择压力小、进化较快的基因序列。

    Cyt b 基因的序列长度在各科之间的差异很大，但科内之间的序列长度是一致的，因此cyt b序列是可用来研究科内属间的系统发育关系（Akihito等，2000；Reed和Carpenter，2002）。NADH作为线粒体呼吸链上的一种功能蛋白，它的基因序列一般很少被用来研究系统发育。从本研究的结果来看，在进行同一个目内科水平亲缘关系较远的种群系统发育分析时，ND4和ND5基因也不乏一个好的研究序列。

也有研究结果表明，在高阶元类群的分子系统发育研究中不要使用cyt b和12S/16S rRNA基因作为分子标记（Meyer，1994；Ortí和Meyer，1997；Farias等，2001），但这些基因仍然作为许多鱼类系统发育的“标准”分子标记而被广泛使用。由于cyt b和12S/16S rRNA基因容易扩增，所以它们被测序的频率与其它线粒体基因相比远远高出4倍多（Miya等，2006）。除此之外，这些基因在系统发育分析上的表现并不比其它线粒体基因表现出更多的*性（Miya和Nishida，2000）。

另外，在重建高水平的系统发育关系上，序列长度逐渐成为一个评价基因特征的重要方面。考虑到类群样本数量的限制，序列约3kb是一个较为理想的长度（Miya等，2006）。ND4+5基因全长3387～3443bp，与cyt b基因（1140bp）相比，包含更多的系统发育信息，将该标记用于分子系统发育分析，可能会得到更为准确的系统发育关系。

就ND4和ND5基因而言，这两个基因单独用于系统发育关系的研究已有很多。张四明等（1999）分析12种鲟形目鱼类的ND4基因的序列变异，确定了部分鲟鱼的亲缘关系。Mou等（2005）以ND4L和ND4基因为标记研究了黑腹果蝇的系统发育关系。张祖兴等（2006）对ND5基因进行克隆和序列分析，进一步确定了大黄鱼的分类地位。Makita等（2000）将ND5应用于虎凤蝶属（ Luehdorfia）的种间研究，结果显示，Luehdorfia 属的种和外群蝴蝶种间ND5基因差异较大，同属内不同物种间ND5基因的差异相对要小。

本研究将ND4和ND5基因联合起来，对鳅超科鱼类的系统发育关系进行分析，重新将各类群之间的关系整理了一遍。

3.2 鳅超科系统发育关系 鳅超科中关于鳅科和平鳍鳅科鱼类划分的问题，一致存在争议。Sawada（1982）和Siebert（1987）基于外部形态和骨骼特征的分析结果认为，鳅科只含两个亚科：花鳅亚科和沙鳅亚科，他们认为条鳅亚科与平鳅鳅科的成员有较近的亲缘关系，条鳅亚科应归为平鳍鳅科的成员。后来的研究认为条鳅亚科和平鳍鳅科的成员在形态上及分子上均存在较大的差异（朱松泉，1995；Nablbant和Bianco，1998；Tang，2006）。Nalbant和Bianco（1998）认为Sawada（1982）研究中所用的骨骼性状，在条鳅亚科和平鳍鳅科中较为相似是因为二者趋同进化形成的，因此Nalbant和Bianco（1998）将条鳅亚科作为一个独立的科对待。Tang（2006）基于线粒体cyt b和Dloop基因的分析结果认为，条鳅亚科和花鳅亚科构成姐妹群，再和平鳍鳅科聚在一起。

本研究立足于分子水平，以ND4+5基因作为分子标记所得出的结果与核基因（Šlechtová等，2007）及线粒体全基因组（Saitoh等，2006）作为分子标记所得出的结果一致，即条鳅亚科和平鳍鳅科构成姐妹群，再和花鳅亚科聚在一起。说明条鳅亚科鱼类与平鳍鳅科鱼类的有更近的亲缘关系。

这种结果的差异可能是由于基因的信息量差异造成的，信息量越大，所反映的系统发育结果可能更加接近真实情况。因此，当样本质量不好导致某些核基因很难扩增出来的时候，ND4+5基因可以作为一个很好的分子标记进行分析。

本研究中，Vaillanla处于所有鳅类的根部位置，成为一个独立的分支，其支持率较高（MP树中为78，ML树中为76，BI树中为100）。曾有研究对Vaillanla的系统发育位置持不同的观点。Sawada（1982）和Siebert（1987）基于形态数据分析研究显示，Vaillanla被分别归为两个不同科的物种。有人提出将这个属划分到一个独立的科Vaillanlidae（Nalbant和Bǎnǎrescu，1977；Šlechtová等，2007）。我们的研究支持这个观点。

分子系统树显示：条鳅亚科中两个南鳅属（Schistura）的物种没有聚类在一起。在MP树中，横纹南鳅（Schistura.fasciolata）与平头平鳅（Oreonectes.platycephalus）聚在一起。而在MP树和BI树中，横纹南鳅（Schistura.fasciolata）与Barbatula.toni聚在一起。由此推断，南鳅属可能不是一个单系。

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