牛牛天天人人综合影院 酶联免疫吸附试验C1q测定法

【资料简介】

1 原理包被于塑料板上的固相凝聚 IgG 与酶联 C1q 的结合受标本中免疫复合物的抑制，是一种竞争性抑制试验。为避免标本中内源 C1q 的干扰，应预先用 IgG 免疫吸附剂将其除去。

    2 材料

    （1） 聚苯乙烯反应板，酶联免疫检测仪。

    （2） 免疫吸附剂系结合有 IgG 的纤维素。取纤维素 （5% ， pH 值 105） 与溴化 * 一起室温反应 10min ，用 01mol/L *缓冲液 （pH 值 80） 充分洗涤。再与 IgG 一起于 4 ℃ 下作用 18h（20ml 缓冲液中含 3g 纤维素和 100mg IgG） 。制备物用 27mol/L *缓冲液 （pH 值 80） 配成 20%（W/V） 悬液，贮于 4 ℃ 。

    （3） 酶联 C1q 用戊二醛法将辣根过氧化物酶标记 C1q ，再经超滤 AmiconXM200 滤膜 ） 分离贮于－ 20 ℃ 。

    （4） 其他试剂 002mol/L TrisHCl 缓冲液 （pH 值 90） ； 02mol/L TrisHCl 缓冲液 （pH

值 7.4） ，以及含 005%Tween20 的同一缓冲液； 02mol/L EDTA （pH 值 76） ；酶底物溶液和中止液。

    3 方法

    （1） 包被凝聚 IgG 取经 002mol/L TrisHCl 缓冲液 （pH 值 90） 透析过夜的凝聚 IgG（100μg/ml） ，加入聚苯乙烯板孔内，每孔 100μl ， 37 ℃ 包被 30min 后，用缓冲液洗 3 次 （ 第 1 次、第 3 次用 02mol/L TrisHCl 缓冲液 （pH 值 74） ；第 2 次用含 005% Tween20 的同一缓冲液 ） , 真空干燥，贮于 4 ℃ 。

    （2） 取血清标本 50μl ，加入 02mol/L EDTA（pH 值 76）50μl ，室温作用 10min ，使内源 C1 q 游离，然后加入 IgG 免疫吸附剂 500μl ，室温振荡 20min ，再以 500r/min 离心 5min ，得到 1 ∶ 10 稀释的上清液。

    （3） 取已包被凝聚 IgG 的塑料反应板，每孔中加入上述上清液 90μl ，酶联 C1q10μl（1 ∶ 100 ～ 200 稀释液 ） ，室温下反应 20min ，然后用含 02mol/L NaCl ， 005%Tween20 的 02mol/L  TrisHCl 缓冲液 （pH 值 74） 洗 3 次，再加入 100μl 底物溶液 （pH 值 60 、 01mol/L 磷酸盐枸橼酸盐缓冲液 50ml 中，加入邻苯二胺 20mg ， 30%（W/V） 过氧化氢 10μl） ，室温放 30min ，加入 2mol/L 硫酸 50μl 中止反应，于 492nm 读取吸光值。如果定量，可用凝聚 IgG 制作标准曲线，测出免疫复合物的相对含量。