牛牛天天人人综合影院 乙醇脱氢酶（ADH）活性测定试剂盒

【资料简介】

测定意义：

ADH 是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物 ADH 主要在肝脏生成，肝脏损伤导致 ADH 释放到血清中。血清 ADH 活性高低反映了肝功能是否异常。

测定原理：

ADH 催化 NADH 还原乙醛生成乙醇和 NAD⁺ ， NADH 在 340nm 处有吸收峰，而 NAD⁺ 没有；测定 340nm 吸光度下降速率，来计算 ADH 活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计 / 酶标仪、微量石英比色皿 /96 孔板、可调式移液器和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 ×1 瓶，室温保存。

试剂二：液体 ×1 瓶， 4 ℃ 保存。临用前把试剂三转移到试剂二中， 4 ℃ 保存。

试剂三：粉剂 ×1 瓶，－ 20 ℃ 保存。

试剂四：液体 ×1 支， 4 ℃ 保存。

粗酶液提取：

1 、称取约 0.1g 样品，加试剂一 1ml ，冰上充分研磨， 16000g 4 ℃ 离心 20min ，取上清待测。 2 、血清可以直接用于测定。

ADH 测定操作：

1. 分光光度计预热 30 min ，调节波长到 340 nm ，蒸馏水调零。

2. 试剂二在 25 ℃ 水浴中保温 30 min 以上。

3. 空白管： 在微量石英比色皿 /96 孔板中依次加入 20μL 蒸馏水、 160μL 试剂二和 20μL 试剂四，迅速混匀后于 340nm 测定吸光值变化，分别记录 15s 和 75s 时吸光值，分别记为 A1 和 A2 。 △ A 空白管 =A1-A2 。空白管只需做 1~2 个。

4. 测定管： 在微量石英比色皿 /96 孔板中依次加入 20μL 上清液、 160μL 试剂二和 20μL 试剂四，迅速混匀后于 340nm 测定吸光值变化，分别记录 15s 和 75s 时吸光值，分别记为 A3 和 A4 。 △ A 测定管 =A3-A4 。

ADH 活性计算：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（ 1 ）按蛋白浓度计算

活性单位定义： 25 ℃ 中每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol NADH 为 1U 。

ADH (U/mg prot) =[(△A 测定管 – △A 空白管 )÷(ε×d)×V 反总 ×10⁶] ÷(Cpr×V 样 )÷T

=1.61×(△A 测定管 – △A 空白管 ) ÷Cpr

（ 2 ） 按样本鲜重计算

活性单位定义： 25℃ 中每克样品每分钟氧化 1μmol NADH 为 1U 。

ADH (U/g 鲜重 ) =[(△A 测定管 – △A 空白管 )÷(ε×d)×V 反总 ×10⁶] ÷ (V 样 ÷V 样总 ×W) ÷T

=1.61×(△A 测定管 – △A 空白管 ) ÷ W

ε ： NADH 摩尔消光系数， 6.22×10³L/mol/cm ； d ：比色皿光径， 1 cm ； V 反总：反应体系总体积， 200μL=2×10^-4 L ； Cpr ：上清液蛋白质浓度， mg/mL ； W ： 样品质量； V 样：加入反应体系中上清液体积， 20μL=0.02 mL ； V 样总：提取液体积， 1 mL ； T ：反应时间， 1min 。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下

（ 1 ）按蛋白浓度计算

活性单位定义： 25℃ 中每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol NADH 为 1U 。

ADH (U/mg prot) =[(△A 测定管 – △A 空白管 )÷(ε×d)×V 反总 ×10⁶] ÷(Cpr×V 样 )÷T

=3.22×(△A 测定管 – △A 空白管 ) ÷Cpr

（ 2 ） 按样本鲜重计算

活性单位定义： 25℃ 中每克样品每分钟氧化 1μmol NADH 为 1U 。

ADH (U/g 鲜重 ) =[(△A 测定管 – △A 空白管 )÷(ε×d)×V 反总 ×10⁶] ÷ (V 样 ÷V 样总 ×W) ÷T

=3.22×(△A 测定管 – △A 空白管 ) ÷ W

ε ： NADH 摩尔消光系数， 6.22×10³L/mol/cm ； d ： 96 孔板光径， 0.5 cm ； V 反总：反应体系总体积， 200μL=2×10^-4 L ； Cpr ：上清液蛋白质浓度， mg/mL ； W ： 样品质量； V 样：加入反应体系中上清液体积， 20μL=0.02 mL ； V 样总：提取液体积， 1 mL ； T ：反应时间， 1min 。

注意事项：

上清液蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。