男女呻吟久久免费视频 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶

【资料简介】

测定意义

AGP (EC 2.7.7.21) 主要存在于植物中， 催化葡萄糖 -1- 磷酸与 ATP 反应生成淀粉合成的直接前体 ADPG ，是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。

测定原理

AGP 催化的逆向反应生成 G1P ，在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和 6- 磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成 6- 磷酸葡萄糖酸和 NADPH ， 340nm 下测定 NADPH 增加速率，即可计算 AGP 活性。

需自备的的仪器和用品

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、 1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂的组成和配制

提取液：液体 30mL×1 瓶， 4 ℃ 保存 ;

试剂一：液体 10mL×1 瓶， 4 ℃ 保存；

试剂二：粉剂 ×1 支， 4 ℃ 保存；临用前加入 250μL 双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂仍 4 ℃ 保存；

试剂三：粉剂 ×1 瓶， 4 ℃ 保存；临用前加入 2mL 双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂仍 4 ℃ 保存；

试剂四：粉剂 ×1 瓶， 4 ℃ 保存；临用前加入 3mL 双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂仍 4 ℃ 保存；

试剂五：粉剂 ×1 瓶， -20 ℃ 保存；临用前加入 3mL 双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂仍 -20 ℃ 保存；

试剂六：粉剂 ×1 支， -20 ℃ 保存；临用前加入 250μL 双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂 4 ℃ 保存；

试剂七：粉剂 ×1 支， -20 ℃ 保存；临用前加入 250μL 双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂 4 ℃ 保存；

粗酶液制备

称取约 0.1g 组织加入 1mL 提取液，冰浴中匀浆。 10000g ， 4 ℃ 离心 10min ，取上清，置冰上待测。

测定步骤 （在 1.5mL EP 管中依次加入下列试剂）：

试剂名称 （ μL ）	测定管
试剂一	100
试剂二	10
试剂三	50
试剂四	100
样本	20

混匀， 30 ℃ 保温 15 min ，置沸水浴中 1 min （盖紧，防止水分散失） ，冰浴迅速冷却

试剂五	100
试剂一	300
试剂六	10
试剂七	10

混匀后立即在 340 nm 波长下记录初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2 ，计算 ΔA=A2-A1 。

AGP 活性 计算

1 、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活性单位。

AGP 活性（ U/mg prot ）＝反应总体积（ 700μL ） ÷ 样本体积（ 20μL ） ÷ 反应时间 (2min)÷NADPH 消光系数（ 6.22×10^-3 ） ×ΔA ÷ 蛋白质浓度（ mg/mL ） =2813×ΔA÷ 蛋白质浓度（ mg/mL ） 。

此法需要自行测定粗酶液蛋白质浓度。

2 、按照样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

AGP 活性（ U/g 鲜重 ） = 反应总体积（ 700μL ） ÷ 样本体积（ 20μL ） ÷ 反应时间 (2min)÷NADPH 消光系数（ 6.22×10^-3 ） ×ΔA ÷ 样本鲜重 (g/mL) =2813×ΔA÷ 样本鲜重 (g/mL)