女人天天干夜夜爽视频 氨基比林-N-脱甲基酶（AND）活性测定试剂盒

【资料简介】

测定意义：

细胞色素P450酶是一组在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物，具有重要作用的酶系。AND作为P450酶系的重要一员，相当于CYP3A4亚型，与药物的去甲基化反应密切相关。

测定原理：

AND 催化氨基比林释放甲醛，通过Nash比色法测定甲醛含量，即可计算出AND活性。

自备仪器和用品：

普通离心机，超速离心机、水浴锅、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水、无水乙醇和冰。

试剂组成和配置：

试剂一：粉剂× 1 瓶， 4 ℃保存。临用前加 100mL 蒸馏水充分溶解。

试剂二：液体× 1 瓶， 4 ℃保存。

试剂三：粉剂× 1 管， 4 ℃避光保存。临用前加入 1mL 无水乙醇，充分溶解。

试剂四：粉剂× 1 管， 4 ℃保存。临用前加入 0.5mL 蒸馏水，充分溶解。

试剂五：粉剂× 1 瓶，室温保存。临用前加蒸馏水 4mL 充分溶解。

试剂六：液体× 1 瓶，室温保存。

试剂七：液体× 1 瓶， 4 ℃保存。

标准液：液体× 1 瓶， -20 ℃保存。临用前取 1.5mL EP 管，加入 10 μl 标准液，加 990 μl 蒸馏水，混匀即为 0.05 mmol/L 标准甲醛溶液， 4 ℃保存。

粗酶液提取：

1 、 除去细胞核，线粒体等大分子物质： 称约 0.5g 组织，加入 1 mL 试剂一，冰上充分研磨， 10 000g 4 ℃离心 30min ，取上清液转入超速离心管。

2 、 粗制微粒体： 4 ℃， 100 000g ，离心 60min ，弃上清液。

3 、除血红蛋白等杂质：向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一，盖紧后充分震荡溶解， 100 000g 离心 30min ，弃上清液。

4 、 终微粒体： 向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5 mL ，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，待测。该待测液需当天使用。

AND 活性测定操作：

1. 分光光度计预热 30 min 以上，调节波长到 412 nm ，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于 37 ℃水浴中预热 30min 以上。

3. 空白管： 取 1 支 EP 管，加入 10 μL 粗酶液， 170 μL 试剂二， 10 μL 试剂三， 10 μL 蒸馏水，混匀后置于 37 ℃水浴保温 30min ；立即加入 35 μL 试剂五，混匀后置于冰浴中 5min ；取出后加入 35 μL 试剂六，混匀后室温静置 5min ；室温 8000rpm 离心 5min ；取新的 EP 管，加入 100 μL 上清液， 100 μL 试剂七，混匀后 60 ℃水浴 10min ，然后取出，用冷水冷却 5min ，于 412nm 测定光吸收，记为 A 空白管。每个样品都需要做空白管。

4. 测定管： 取 1 支 EP 管，加入 10 μL 粗酶液， 170 μL 试剂二， 10 μL 试剂三， 10 μL 试剂四，混匀后置于 37 ℃水浴保温 30min ；立即加入 35 μL 试剂五，混匀后置于冰浴中 5min ；取出后加入 35 μL 试剂六，混匀后室温静置 5min ；室温 8000rpm 离心 5min ；取 1 支新 EP 管，加入 100 μL 上清液， 100 μL 试剂七，混匀后 60 ℃水浴 10min ，然后取出，用冷水冷却 5min ，于 412nm 测定光吸收，记为 A 测定管。

5. 标准管： 取 1 支 EP 管，加入 100 μL 标准品， 100 μL 试剂七，混匀后 60 ℃水浴 10min ，然后取出，用冷水冷却 5min ，于 412nm 测定光吸收，记为 A 标准管。

AND 活性计算：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（ 1 ）按蛋白浓度计算

活性单位（ U ）定义： 37 ℃中每分钟每毫克蛋白催化产生 1 μmol 甲醛。

AND 活性 (U/mg prot) = C 标准品× V 标准品×（ A 测定管－ A 空白管）÷（ A 标准管－ A 空白管）×稀释倍数÷（ Cpr × V 样）÷ T

=0.045 ×（ A 测定管－ A 空白管）÷（ A 标准管－ A 空白管）÷ Cpr 。

（ 2 ）按样本鲜重计算

活性单位（ U ）定义： 37 ℃中每分钟每克组织催化产生 1 μmol 甲醛。

AND 活性 (U/g 鲜重 ) = C 标准品× V 标准品×（ A 测定管－ A 空白管）÷（ A 标准管－ A 空白管）×稀释倍数÷ (V 样÷ V 样总× W) ÷ T

=0.045 ×（ A 测定管－ A 空白管）÷（ A 标准管－ A 空白管）÷ W 。

C 标准品： 0.05 mmol/L=50 μmol/L ； V 标准品： 500 μL =0.0005 L ；稀释倍数： V 反总÷ V 上清液 = （ 50+850 +50+50+175+175 ）÷ 500=2.7 ； Cpr ：粗酶液蛋白质浓度（ mg/mL ），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒； V 样：加入粗酶液体积， 50 μL =0.05mL ； V 样总：提取液体积， 1 mL ； T ：催化反应时间（ min ）， 30min 。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下

（ 1 ）按蛋白浓度计算

活性单位（ U ）定义： 37 ℃中每分钟每毫克蛋白催化产生 1 μmol 甲醛。

AND 活性 (U/mg prot) = C 标准品× V 标准品×（ A 测定管－ A 空白管）÷（ A 标准管－ A 空白管）×稀释倍数÷（ Cpr × V 样）÷ T

=0.045 ×（ A 测定管－ A 空白管）÷（ A 标准管－ A 空白管）÷ Cpr 。

（ 2 ）按样本鲜重计算

活性单位（ U ）定义： 37 ℃中每分钟每克组织催化产生 1 μmol 甲醛。

AND 活性 (U/g 鲜重 )  = C 标准品× V 标准品×（ A 测定管－ A 空白管）÷（ A 标准管－ A 空白管）×稀释倍数÷ (V 样÷ V 样总× W) ÷ T

=0.045 ×（ A 测定管－ A 空白管）÷（ A 标准管－ A 空白管）÷ W 。

C 标准品： 0.05 mmol/L=50 μmol/L ； V 标准品： 500 μL =0.0005 L ；稀释倍数： V 反总÷ V 上清液 = （ 50+850 +50+50+175+175 ）÷ 500=2.7 ； Cpr ：粗酶液蛋白质浓度（ mg/mL ），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒； V 样：加入粗酶液体积， 50 μL =0.05mL ； V 样总：提取液体积， 1 mL ； T ：催化反应时间（ min ）， 30min 。

注意事项：

1 、粗酶液需在当日完成测定，如需保存，则向粗酶液提取步骤 3 的沉淀中加 0.5ml 20% 的甘油，分装后， -80 ℃保存；

2 、试剂三和试剂四需临用前配制，如当天没有用完， 4 ℃避光保存，可用 1 周；

3 、粗酶液可直接用于蛋白浓度测定，建议用 BCA 法测蛋白含量。