人疱疹病毒-7型感染IgM抗体（HHV-7 IgM）（ELISA）

【资料简介】

l 本试剂盒用于体外定性检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人疱疹病毒 -7型感染IgM抗体（HHV-7 IgM）。

l 有效期： 6个月

l 保存条件： 2-8℃

实验原理

试剂盒采用间接法酶联免疫吸附试验（ ELISA）。往预先包被人疱疹病毒-7型感染IgM抗体（HHV-7 IgM）捕获抗原的包被微孔中，依次加入标本、阴性和阳性对照，再加入HRP标记的检测抗体，经过温育并*洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人疱疹病毒-7型感染IgM抗体（HHV-7 IgM）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），判定阴阳性。

样本处理及要求

1. 血清： 将收集于血清分离管的全血标本在室温放置 2 小时或 4 ℃过夜，然后 1000 × g 离心 20 分钟，取上清即可，或将上清置于 -20 ℃或 -80 ℃保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆： 用 EDTA 或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的 30 分钟内于 2-8 ℃ 1000 × g 离心 15 分钟，取上清即可检测，或将上清置于 -20 ℃或 -80 ℃保存，但应避免反复冻融。
3. 组织匀浆： 用预冷的 PBS (0.01M, pH=7.4) 冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的 PBS （一般按 1:9 的重量体积比，比如 1g 的组织样品对应 9mL 的 PBS ，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于 5000 × g 离心 5~10 分钟，取上清检测。

4. 细胞培养物上清或其它生物标本： 请 1000 × g 离心 20 分钟，取上清即可检测，或将上清置于 -20 ℃或 -80 ℃保存，但应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

需要而未提供的试剂和器材

§ 酶标仪（ 450nm ）

§ 高精度加样器及枪头： 0.5-10uL 、 2-20uL 、 20-200uL 、 200-1000uL

§ 37℃ 恒温箱

§ 蒸馏水或去离子水

试剂盒组成

名称	96 孔配置	48 孔配置	备注
微孔酶标板	96 孔	48 孔	无
阴性对照	0. 3 mL	0. 3 mL	无
阳性对照	0. 3 mL	0. 3 mL	无
样本稀释液	6mL	3mL	无
检测抗体-HRP	10mL	5mL	无
20× 洗涤缓冲液	25mL	15mL	按说明书进行稀释
底物A	6mL	3mL	无
底物B	6mL	3mL	无
终止液	6mL	3mL	无
封板膜	2 张	2 张	无
说明书	1 份	1 份	无
自封袋	1 个	1 个	无

注意事项

§ 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温 20-25℃ 。使用后立即冷藏保存试剂。

§ 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

§ 消除板底残留的液体和手指印，否则影响 OD 值。

§ 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

§ 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

§ 在储存和温育时避免强光直接照射。

§ 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

§ 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

§ 不能使用过期产品。

§ 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置 。

试剂准备

试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。

2 0× 洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按 1 ： 20 稀释，即 1 份 20× 洗涤缓冲液加 19 份蒸馏水。

操作步骤

1. 从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回 4℃ 。

2. 设置阴性对照孔、阳性对照孔和样本孔，阴性、阳新对照孔各加 50μL 对照品，样本孔中加入待测样本 5 0μL ，空白孔不加。

3. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（ HRP ）标记的检测抗体 100μL ，用封板膜封住反应孔， 37℃ 水浴锅或恒温箱温育 60 min 。

4. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（ 350 μL ），静置 1min ，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次（也可用洗板机洗板）。

5. 每孔加入底物 A 、 B 各 50μL ， 37℃ 避光孵育 15min 。

6. 每孔加入终止液 50μL ， 15min 内，在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。

实验结果计算

1. 阴性对照 OD 值：小于 0.2 。

2. 阳性对照 OD 值：大于 0.8 。

3 、阳性判断（ Cut-Off 值）：阴性对照 OD 值 +0.25 ，样本 OD 值大于阈值，判定为阳性，反之，为阴性。

4 、重复性：板内变异系数小于 15% 。

5 、储藏： 2-8 ℃避光密封保存。