大豆凝集素（SBA）酶联免疫分析（ELISA）试剂配置及操作步骤

【资料简介】

大豆凝集素（SBA） 酶联免疫分析（ ELISA ）

试剂盒使用说明书

本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中大豆凝集素（SBA）含量。

实验原理：

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大豆凝集素（ SBA ）水平。用纯化的大豆凝集素（ SBA ）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入大豆凝集素（ SBA ），再与 HRP 标记的大豆凝集素（ SBA ）抗体结合，形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物 TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的大豆凝集素（ SBA ）呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），通过标准曲线计算样品中大豆凝集素（ SBA ）浓度。

试剂盒组成 ：

试剂盒组成	48 孔配置	96 孔配置	保存
说明书	1 份	1 份
封板膜	2 片（ 48 ）	2 片（ 96 ）
密封袋	1 个	1 个
酶标包被板	1 × 48	1 × 96	2-8 ℃ 保存
标准品： 900n g/L	0.5ml × 1 瓶	0.5ml × 1 瓶	2-8 ℃ 保存
标准品稀释液	1.5ml × 1 瓶	1.5ml × 1 瓶	2-8 ℃ 保存
酶标试剂	3 ml × 1 瓶	6 ml × 1 瓶	2-8 ℃ 保存
样品稀释液	3 ml × 1 瓶	6 ml × 1 瓶	2-8 ℃ 保存
显色剂 A 液	3 ml × 1 瓶	6 ml × 1 瓶	2-8 ℃ 保存
显色剂 B 液	3 ml × 1 瓶	6 ml × 1 瓶	2-8 ℃ 保存
终止液	3ml × 1 瓶	6ml × 1 瓶	2-8 ℃ 保存
浓缩洗涤液	（ 20ml × 20 倍）× 1 瓶	（ 20ml × 30 倍）× 1 瓶	2-8 ℃ 保存

标本要求：

1 ．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可 将标本放于 -20 ℃ 保存，但 应避免反复冻融

2．不能检测含NaN3的样品 ，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（ HRP ）活性。

操作步骤：

1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔 10 孔，在*、第二孔中分别加标准品 100μl ，然后在*、第二孔中加标准品稀释液 50μl ，混匀；然后从*孔、第二孔中各取 100μl 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50μl ，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 弃掉，再各取 50μl 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul ，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取 50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50μl ，混匀后从第七、第八孔中分别取 50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液 50μl ，混匀后从第九第十孔中各取 50μl 弃掉。（稀释后各孔加样量都为 50μl ，浓度分别为 600n g/L ， 400n g/L ， 200n g/L ， 100n g/L ， 50n g/L ）。

2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、 待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40 μ l ，然后再加待测样品 10 μ l （样品zui终稀释度为 5 倍）。 加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 温育：用封板膜封板后置 37 ℃ 温育3 0 分钟。

4. 配液：将 30 （ 48T 的 20 倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 （ 48T 的 20 倍）倍稀释后备用。

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50μl ，空白孔除外。

7. 温育：操作同 3 。

8. 洗涤：操作同 5 。

9. 显色：每孔先加入显色剂 A50μl ，再加入显色剂 B50μl ，轻轻震荡混匀， 37 ℃ 避光显色15分钟.

10. 终止：每孔加终止液 50μl ，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11. 测定：以空白空调零， 450nm 波长依序测量各孔的吸光度（ OD 值）。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。

注意事项：

1． 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2． 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3． 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4． 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值大于标准品孔*孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（ n 倍）后再测定，计算时请zui后乘以总稀释倍数（ ×n×5 ）。

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6． 底物请避光保存。

7． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准 .

8． 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9． 本试剂不同批号组分不得混用。

10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

计算：

以标准物的浓度为横坐标， OD 值为纵坐标，

在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD

值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释

倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标

准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值

代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释

倍数，即为样品的实际浓度。

（此图仅供参考）

试剂盒性能：

1. 样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.95 以上。

2. 批内与批见应分别小于 9% 和 11%

检测范围：

30n g/L -700n g/L

保存条件及有效期：

1. 试剂盒保存： ； 2-8 ℃ 。

2 ．有效期： 6 个月