牛牛天天人人综合影院 士锋生物关于如何转基因小鼠报告的详细介绍

【资料简介】

在研发转基因小鼠或基因嵌入报告基因模式小鼠的过程中，经常要用到报告基因。常用的报告基因包括： lacZ 、 EGFP 、 zsGreen 、 EYFP 、 DsRed （DsRed2） 、 mRFP 、 mCherry 、 HuCD2 、 Thy1.1 、 HA tag 、 FLAG tag 、 Luciferase 等。那什么时候选择哪种 reporter 呢 ?

做小鼠胚胎发育的研究人员一般喜欢用 LacZ ，也就是将 LacZ 置于一个启动子的调节之下。用 LacZ 可以进行胚胎全身染色 （whole body staining） ，这样可以了解一个基因在体内的表达谱全貌。如果做细胞跟踪，比如免疫细胞，神经细胞等，一般喜欢用荧光蛋白。这样一是容易对细胞进行分离 （ 比如 FACS） 和体外分析，二是容易对分离的细胞进行体内追踪 （ 比如 Adoptive transfer） 。早些年用的zui多的是 EGFP 和 EYFP 。有的时候，我们需要将两种不同的 reporter 小鼠交配在一起，研究两个基因的关系，这时可以将两个基因采用不同的荧光蛋白进行标记，也就是做两种不同的模式小鼠。因为早期大家多是用 EGFP ，现在可以多做一些其它荧光蛋白的报告基因小鼠，以便跟以前研发的 EGFP 小鼠结合起来研究。 zsGreen 和 EGFP, EYFP 都是绿色荧光。 EGFP 和 EYFP 很难区分开。 zsGreen 是一个比较稳定的绿色荧光蛋白。 DsRed 和 TdTomato 都是红色荧光。这两种荧光蛋白都有报告基因模式小鼠发表。 TdTomato 是一个信号非常强的荧光蛋白，目前已经有报告基因小鼠发表，对细胞 / 小鼠也没有明显的毒性。相信以后会有越来越多的小鼠用 TdTomato 来做报告基因。虽然 mRFP 和 mCherry 是两个非常好的荧光蛋白，但由于它们需要 584nm 的激发光，所以一般的 FACS 仪器不能检测到信号，需要用到 LSRII 这样的仪器，而很多实验室可能没有这样的仪器。也有用 EBFP, ECFP 做细胞实验的，但用到小鼠上的比较少。比如需要用到紫外光来激发。如果想在一个小鼠里表达两种荧光蛋白，是用两种分得比较开的，比如，不要同时用 EGFP 和 EYFP 。

HuCD2 和 Thy1.1 是细胞表面受体。 HuCD2 因为去掉了 C-term 序列，使得其失去了信号传导的功能。那什么时候会用这两种分子呢 ? 比如我们想研究一个细胞内蛋白基因 （ 比如转录因子 ） 的功能，经常需要把表达这个蛋白的细胞分离纯化出来。这个时候可以将 HuCD2 或 Thy1.1 报告基因放置在这个细胞内蛋白基因启动子下 （ 比如加一个 IRES-Thy1.1）, 这样所有表达这个细胞内蛋白的细胞都会在细胞表面表达 Thy1.1 。这样就可以用 anti-Thy1.1 抗体将这一群细胞分离出来，进行后续研究。当然也可以用 anti-Thy1.1 抗体进行组织切片的免疫荧光检测。

HA 、 FLAG 、 Biotin 等是细胞和生化实验中常用的标签多肽或蛋白。在 Western blot ，免疫沉淀 （Immunoprecipitation） 等实验中经常用到，因为有非常特异的 HA 、 Flag 抗体。 Biotin 可以跟 （Streptavidin） 直接结合并用于免疫沉淀。在模式小鼠中，这些标签多肽或蛋白可以与要研究的蛋白做成融合蛋白。这种模式小鼠zui常被用到的是 Chip-chip 实验。比如要研究一个转录因子的功能，就需要知道这个转录因子在细胞内 （ 正常或刺激条件下 ） 结合到染色体基因组 DNA 的位置以及结合序列。我们知道，特异性好、亲和力高的抗转录因子的抗体非常不容易得到或制备。这个时候可以将标签多肽 （ 比如 FLAG） 放在转录因子的 C-term ，做成融合蛋白。刺激细胞之后，对细胞进行化学交联，并破碎细胞以及基因组 DNA ，然后用 anti-FLAG 抗体作免疫沉淀，将转录因子沉淀下来。zui后分析这些转录因子所结合的 DNA 段序列，从而找到该转录因子的在基因组上的识别序列，也就找到了该转录因子的作用基因。

荧光素酶做报告基因模式小鼠，一般是为了做活体成像实验。比如在一个细胞因子启动子下面放置荧光素酶基因。免疫小鼠之后，有些细胞或器官表达该细胞因子同时表达荧光素酶。通过注射荧光素酶底物可以检测荧光在小鼠体内的分布，从而得出该细胞因子在不同免疫条件下的表达情况。荧光素酶在癌症研究中也经常用。通过荧光活体成像可以研究肿瘤细胞的发生和转移。