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人
N-乙酰
-
β
-D-
氨基葡萄糖苷酶(
NAG
)
酶联免疫
分析
试剂
盒使用说明书
本试剂仅供研究使用
目的:本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)
的
含量。
实验原理
:
本试剂盒应用双抗体夹心法测定
标本
中
人N-
乙酰
-
β
-D-
氨基葡萄糖苷酶(
NAG
)
水平。用纯化的
人N-
乙酰
-
β
-D-
氨基葡萄糖苷酶(
NAG
)
抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入
N-乙酰
-
β
-D-
氨基葡萄糖苷酶(
NAG
)
抗原
,再与HRP
标记的
N-乙酰
-
β
-D-
氨基葡萄糖苷酶(
NAG
)
抗体结合,形成抗体-
抗原
-
酶标抗体复合物
,经过*洗涤后
加
底物TMB
显色。
TMB
在
HRP
酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的
N-乙酰
-
β
-D-
氨基葡萄糖苷酶(
NAG
)
呈正相关。用酶标仪在
450
nm波长下测定吸光度(
OD
值),
通过标准曲线
计算样品
中
人N-
乙酰
-
β
-D-
氨基葡萄糖苷酶(
NAG
)
浓度。
试剂盒组成
:
试剂盒组成
|
48孔配置
|
96孔配置
|
保存
|
说明书
|
1份
|
1份
|
|
封板膜
|
2片(
48
)
|
2片(
96
)
|
|
密封袋
|
1个
|
1个
|
|
酶标包被板
|
1×
48
|
1×
96
|
2-8℃保存
|
标准品:270 U/L
|
0.5ml×
1
瓶
|
0.5ml×
1
瓶
|
2-8℃保存
|
标准品稀释液
|
1.5ml×
1
瓶
|
1.5ml×
1
瓶
|
2-8℃保存
|
酶标试剂
|
3 ml×
1
瓶
|
6 ml×
1
瓶
|
2-8℃保存
|
样品稀释液
|
3 ml×
1
瓶
|
6 ml×
1
瓶
|
2-8℃保存
|
显色剂A
液
|
3 ml×
1
瓶
|
6 ml×
1
瓶
|
2-8℃保存
|
显色剂B
液
|
3 ml×
1
瓶
|
6 ml×
1
瓶
|
2-8℃保存
|
终止液
|
3ml×
1
瓶
|
6ml×
1
瓶
|
2-8℃保存
|
浓缩洗涤液
|
(20ml
×
20
倍)×
1
瓶
|
(20ml
×
30
倍)×
1
瓶
|
2-8℃保存
|
样本处理及要求
:
1.血清:室温血液自然凝固
10-20
分钟,离心
20
分钟左右(
2000-3000
转
/
分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。
2.血浆:应根据标本的要求选择
EDTA
或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合
10-20
分钟后,离心
20
分钟左右(
2000-3000
转
/
分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。
3.尿液:用无菌管收集,离心
20
分钟左右(
2000-3000
转
/
分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4.细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心
20
分钟左右(
2000-3000
转
/
分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用
PBS
(
PH7.2-7.4
)稀释细胞悬液,细胞浓度达到
100
万
/ml
左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心
20
分钟左右(
2000-3000
转
/
分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
5.组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的
PBS
,
PH7.4
。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持
2-8
℃的温度。加入一定量的
PBS
(
PH7.4
),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心
20
分钟左右(
2000-3000
转
/
分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。
6.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可
将标本放于
-20
℃保存,但
应
避免反复冻融
.
7.
不能检测含NaN3的样品
,因NaN3
抑制辣根过氧化物酶的(
HRP
)活性。
操作步骤
1.
标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10
孔,在*、第二孔中分别加标准品
100
μ
l,然后在*、第二孔中加标准品稀释液
50
μ
l,混匀;然后从*孔、第二孔中各取
100
μ
l分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液
50
μ
l,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取
50
μ
l弃掉,再各取
50
μ
l分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液
50ul
,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取
50
μ
l分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液
50
μ
l,混匀后从第七、第八孔中分别取
50
μ
l加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液
50
μ
l,混匀后从第九第十孔中各取
50
μ
l弃掉。(稀释后各孔加样量都为
50
μ
l,浓度分别为
180 U/L
,
120 U/L
,
60 U/L
,
30 U/L
,
15U/L
)。
2.
加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、
待测样品孔
。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40
μ
l,然后再加待测样品
10
μ
l(样品zui终稀释度为
5
倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,
轻轻
晃动
混匀
。
3.
温育:用封板膜封板后置37
℃温育3
0
分钟
。
4.
配液:将30
(
48T
的
20
倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水
30
(
48T
的
20
倍)倍稀释后备用。
5.
洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,
甩干
,每孔加满洗涤液,静置30
秒后弃去,如此重复
5
次,拍干。
6.
加酶:每孔加入酶标试剂50
μ
l,空白孔除外
。
7.
温育:操作同3
。
8.
洗涤:操作同5
。
9.
显色:每孔先加入显色剂A50
μ
l,再加入显色剂
B50
μ
l,轻轻震荡混匀,
37
℃避光显色15分钟.
10.
终止:每孔加终止
液50μl
,终止反应
(此时蓝色立转黄色)
。
11.
测定:以空白空调零,
4
50
nm波长依序测量各孔的
吸光
度(OD
值)
。
测定应在加终止液后15
分钟以内进行。
注意事项:
1.
试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30
分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。
2.
浓洗涤液
可能
会有
结晶
析出,稀释时可在水浴中加温助溶
,洗涤时不影响结果。
3.
各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间控制在5
分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
4.
请每次测定的同时做标准曲线,做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD
值大于标准品孔*孔的
OD
值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(
n
倍)后再测定,计算时请zui后
乘以
总稀释倍数(
×n×5
)。
5.
封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6.
底物请避光保存。
7.
严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8.
所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9.
本试剂不同批号组分不得混用。
10.如与英文说明书有异,以英文说明书为准。
计算
:
以标准物的浓度为横坐标,OD
值为纵坐标,
在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD
值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以
稀释
倍数
;或用标准物的浓度与OD
值计算出标
准曲线的直线回归方程式,将样品的OD
值
代入方程式,计算出样品浓度,再乘以
稀释
倍数
,即为样品的实际浓度。
(此图仅供参考)
试剂盒性能:
1.样品线性回归与预期浓度相关系数
R
值为
0.95
以上。
2.批内与批间应分别小于
9%
和
11%
检测范围:
10 U/L
-
200 U/L
保存条件及有效期:
1.试剂盒保存:
;2-8
℃
。
2.有效期:
6
个月