小鼠（Mouse）血管内皮生长因子（VEGF）ELISA 检测试剂盒

【资料简介】

中文说明书 UNIONHONEST

酶联免疫吸附测试 Enzyme Linked Immunosorbent Assay

小鼠 （Mouse） 血管内皮生长因子（ VEGF ） ELISA 检测试剂盒

本试剂仅供研究使用 标本：血清或血浆

试验原理 ：

VEGF 试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ ELISA ） . 已知 VEGF 浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将 VEGF 和*标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的 HRP 。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物 A 、 B ，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中 VEGF 的浓度呈比例关系。

试剂盒内容及其配制

试剂盒成份（ 2-8 ℃保存）	96 孔配置	48 孔配置	配制
96/48 人份酶标板	1 块板（ 96T ）	半块板（ 48T ）	即用型
塑料膜板盖	1 块	半块	即用型
标准品： 40ng/ml	1 瓶（ 0.6ml ）	1 瓶（ 0.3ml ）	按说明书进行稀稀
空白对照	1 瓶（ 1.0ml ）	1 瓶（ 0.5ml ）	即用型
标准品稀释缓冲液	1 瓶（ 5ml ）	1 瓶（ 2.5ml ）	即用型
*标记的抗 VEGF 抗体	1 瓶（ 6ml ）	1 瓶（ 3.0ml ）	即用型
亲和链酶素 -HRP	1 瓶（ 10ml ）	1 瓶（ 5.0ml ）	即用型
洗涤缓冲液	1 瓶（ 20ml ）	1 瓶（ 10ml ）	按说明书进行稀释
底物 A	1 瓶（ 6.0ml ）	1 瓶（ 3.0ml ）	即用型
底物 B	1 瓶（ 6.0ml ）	1 瓶（ 3.0ml ）	即用型
终止液	1 瓶（ 6.0ml ）	1 瓶（ 3.0ml ）	即用型

自备材料

1． 蒸馏水。

2． 加样器： 5ul 、 10ul 、 50ul 、 100ul 、 200ul 、 500ul 、 1000ul 。

3． 振荡器及磁力搅拌器等。

安全性

1． 避免直接接触终止液和底物 A 、 B 。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。

2． 实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。

3． 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

操作注意事项

1． 试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

2． 实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

3． 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

4． 使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物 A 、 B 液时，避免使用带金属部分的加样器。

5． 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。

6． 洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

7． 底物 A 应挥发，避免长时间打开盖子。底物 B 对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取 OD 值。

8． 加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。

9． 按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

样品收集、处理及保存方法

1、 血清 ----- 操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后， 1000 × g 离心 10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2、 血浆 -----EDTA 、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。 1000 × g 离心 30 分钟去除颗粒。

3、 细胞上清液 ---1000 × g 离心 10 分钟去除颗粒和聚合物。

4、 保存 ------ 如果样品不立即使用，应将其分成小部分 -70 ℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在 37 ℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

试剂的准备

1． 标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：

40 ng/ml	（ 6 号标准品）	原倍浓度不用稀释直接加入 50ul 。
20 ng/ml	（ 5 号标准品）	100ul 的原倍标准品加入 100ul 的标准品稀释液
10 ng/ml	（ 4 号标准品）	100ul 的 5 号标准品加入 100ul 的标准品稀释液
5.0 ng/ml	（ 3 号标准品）	100ul 的 4 号标准品加入 100ul 的标准品稀释液
2.5 ng/ml	（ 2 号标准品）	100ul 的 3 号标准品加入 100ul 的标准品稀释液
1.25 ng/ml	（ 1 号标准品）	100ul 的 2 号标准品加入 100ul 的标准品稀释液
0 ng/ml	（空白对照）	原始浓度不用稀释直接加入 50ul 。

2． 洗涤缓冲液（ 50 ×）的稀释：蒸馏水 50 倍稀释。

操作步骤

1． 使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2． 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3． 加入稀释好后的标准品 50ul 于反应孔、加入待测样品 50ul 于反应孔内。立即加入 50ul 的*标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀， 37 ℃温育 1 小时。

4． 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡 30 秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作 3 次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5． 每孔加入 80ul 的亲和链酶素 -HRP ，轻轻振荡混匀， 37 ℃温育 30 分钟。

6． 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡 30 秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作 3 次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7． 每孔加入底物 A 、 B 各 50ul ，轻轻振荡混匀， 37 ℃温育 10 分钟。避免光照。

8． 取出酶标板，迅速加入 50ul 终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9． 在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。

建议使用的实验方案

标准品浓度（ ng/ml ）

A

40

40

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

B

20

20

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

C

10

10

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

D

5.0

5.0

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

E

2.5

2.5

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

F

1.25

1.25

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

G

0

0

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

H

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

样品

局限

6 号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到的结果。

试剂盒性能

1. 灵敏度：zui小的检测浓度小于 1 号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.990 。

2. 特异性：不与其它细胞因子反应。

3. 重复性：板内、板间变异系数均小于 10% 。

结果 判 断 与 分 析

1 、仪器值：于波长 450nm 的酶标仪上读取各孔的 OD 值

2 、以吸光度 OD 值为纵坐标（ Y ），相应的 VEGF 标准品浓度为横坐标（ X ），做得相应的曲线，样品的 VEGF 含量可根据其 OD 值由标准曲线换算出相应的浓度。

3 、 检测值范围： 0-40ng/ml

4 、敏感度： 0.1 ng/ml