牛牛天天人人综合影院 单克隆抗体制备技术方法

【资料简介】

一、单克隆抗体的产生
    经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养(除及时冻存的细胞外)。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。
    大量制备单克隆抗体的方法有两类：一类是动物体内诱生法，另一类是体外培养法。
    (一).动物体内诱生法
　　接种动物常选用BALB/c小鼠或与BALB/c小鼠杂交的Fl代小鼠。接种前l周左右，于小鼠腹腔内注入降植烷或医用液状石蜡0.5ml。每次小鼠腹腔注射0.5×10 ⁶ ～1×10 ⁶ 个杂交瘤细胞。接种后7～10天，小鼠腹部逐渐长大，诱生出腹腔肿瘤并产生含单克隆抗体的腹腔积液。接种后10～14天，可分次采集腹腔积液，1只可得10～20ml(5～20mg/m1)。收集到的腹腔积液，离心去除细胞，灭活(56℃、30min)，再次离心，取上清液，加入0.1%叠氮钠，分装保存于-20℃。如冻干保存，抗体效价可保持更久。
    (二).体外培养法
    将杂交瘤细胞接种到培养瓶中，在5%C02，37℃孵箱中培养数天后，收集上清液，离心去除细胞和碎片。本法所得抗体含量不高，为5～25pg/ml。但仍可满足部分实验的要求。另一种是杂交瘤细胞高密度培养，分两种类型：一类是悬浮培养系统，即采用转瓶或发酵罐式的生物反应器；另一类是细胞固定化培养系统，包括中空纤维细胞培养系统和微囊化细胞培养系统。高密度培养可使单位体积单克隆抗体含量明显增加，产量可达lg/L。
二、单克隆抗体的纯化
    从培养液或腹腔积液获得的单克隆抗体，不需要纯化即可应用于日常诊断或定性研究。由于其中含有大量来自培养基、宿主或克隆细胞本身的一些无关蛋白，如果用于免疫标记测定，如放射性核素、酶、荧光素或*标记等，必须进一步分离和纯化。无论培养液、腹腔积液或血清，均可先用半饱和、饱和硫酸铵进行沉淀，达到初步浓缩和纯化的目的。经过适当溶解和充分稀释后，可用亲和层析法进一步纯化。
三、单克隆抗体的性质鉴定
    当获得多个杂交瘤细胞株时，要了解哪一株是zui适用的，则一定要通过各种鉴定。常见的方法有：
    (一)Ig类型测定
    通常以免抗小鼠Ig类及亚类抗体与培养液中单克隆抗体按双向琼脂扩散法进行测定，确定其Ig类型或Ig亚类型别。
    (二)特异性测定
    把与相应抗原有关的物质同McAb进行多种免疫学检测，鉴定McAb的特异性。这直接关系到McAb应用的可靠性。
    (三)抗体效价测定
    效价以腹腔积液或培养液的稀释度表示，稀释度越高，则抗体效价也越高。在凝集反应中，腹腔积液效价可达5万以上；在ELISA中，腹腔积液效价可达100万以上。如ELISA效价低于10万，用于诊断测定将不会达到很高的敏感度，应重新制备。
    (四)表位测定
    通过双向琼脂扩散法，把两种McAb混合，加入于同一孔中，对孔放相应的抗原，如出现两条沉淀线可证明两者为抗不同表位的McAb；利用ELISA双抗夹心法，将一种McAb作包被抗体，另一作酶标记，其中加入抗原，如显色，则证明两者抗不同的表位。
    (五)亲和力测定
    只有当抗原与抗体结合部位结构*吻合时，抗体的亲和力zui大。这种结合力以抗原抗体反应平衡时，抗原与抗体浓度的乘积与抗原抗体复合物浓度之比表示。如亲和力太低，会严重影响测定的敏感性。
    (六)染色体分析
    正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒；小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为62～68，NS-1为54～64。大多数为非整倍性，有中部和亚中部着丝点。杂交瘤细胞的染色体数目接近两亲本细胞染色体数目的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外．还应出现少数标志染色体。染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌价的抗体。