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PCR鉴定试剂盒实验步骤与注意要点

2023-1-29  阅读(162)

PCR鉴定试剂盒实验步骤:

 

1、取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其wan全溶解。

 

2、两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

 

3、RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

 

4、RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。

 

5、RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

 

6、溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其wan全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。


PCR鉴定试剂盒注意要点:

 

1. 建议使用新鲜采取的动物组织,若为长期冷冻组织,应尽量避免反复冻融,否则会导致模板的降解,影响PCR效率。

 

2. 试剂Buffer AL若低温保存,易产生沉淀。在使用前务必将其在室温中放置一段时间,也可在37℃水浴中预热10 min,以溶解沉淀,混匀后再使用。

 

3. 电泳检测时,切勿使用含有SDS的Loading Buffer。否则,电泳时会在泳道中出现一大团拖尾亮带,影响实验结果。

 

4. 建议扩增片段长度1 kb以内,以便扩增效率佳。

 

5. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。




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