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列举PCR引物设计的基本原则

2023-2-10  阅读(136)

引物设计的原则:

1.引物长度:一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,即Taq酶的最适温度。

2.引物的特异性:引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

3.序列Tm值:引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度。退火温度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5~8)

4.G+C含量:有效引物中(G+C)的比例为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5. 引物的3′端:引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰;引物3’端的碱基一般不用A,因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高; 引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败

6.引物的5′端:引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物su、荧光、di高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。 




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