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上海邦景实业有限公司
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检测细胞衰老方法
2023-4-23 阅读(122)
细胞衰老是细胞在正常环境条件下发生的功能减退、逐渐趋向死亡的现象。衰老的细胞表现为细胞体积变大，呈扁平状；细胞核变大，核膜内陷，染色质聚集、固缩、裂解；胞质内颗粒增加，有空泡形成；线粒体的数目及形状发生改变；膜流动性降低；溶酶体内容物增多，导致溶酶体酶β-半乳糖苷酶活性升高。衰老细胞所具有的上述特征成为各种细胞衰老检测手段的依据。
细胞衰老检测方法与步骤:
（1）细胞接种前在6孔培养板中预先放置灭菌的细胞片，每孔加入1×10E5个细胞，37℃ 5% CO2条件下培养过夜，使细胞在细胞片上生长。
（2）在超净工作台中吸弃6孔培养板中的培养液，加入×1 PBS，洗涤细胞1次，随后加入2%甲醛/0.2%戊二醛固定液，室温条件下固定3~5分钟。
（3）吸弃2%甲醛/0.2%戊二醛固定液，加入×1 PBS，洗涤细胞3次，每次3分钟。
（4）吸弃×1 PBS，加X-Gal溶液以浸没细胞片为宜，37℃孵育4~8小时或过夜，用保鲜膜包被6孔培养板以防染液蒸发。
（5）取出细胞爬片，去离子水冲洗2次，再次用固定液固定4分钟，流水轻轻冲洗。
（6）将细胞爬片按此顺序脱水、透明∶95%酒精I（2分钟）→95%酒精Ⅱ（2分钟）→100%酒精I（2分钟）→100%酒精I（5分钟）→二甲苯I（2分钟）→二甲苯Ⅱ（2分钟）。
（7）中性树胶封片。
（8）在普通光学显微镜下观察衰老细胞形态。
每张片子镜下计数400个细胞，确定X-Gal染色阳性细胞（衰老细胞）在细胞群体中的所占的百分比即衰老细胞率（蓝染细胞数/总计细胞数×100%）。
注意事项:
（1）X-Gal溶液需要现用现配。
（2）细胞固定时间过长或固定之后清洗不干净，均会影响后续的酶反应。
