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上海邦景实业有限公司
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PCR反应体系解析
2023-5-4 阅读(219)
PCR反应体系解析如下：
1、引物
引物与模板配对的长度应至少为17个核苷酸，最高不宜超过30个核苷酸，最佳长度为20-24个核苷酸，如需插入酶切位点，应在酶切位点5'端多加几个碱基，有利于酶切。引物的（G+C）%含量组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体；两个引物中（G+C）%含量应尽量相似；引物内部应避免形成明显的二级结构，如发夹结构；两个引物之间不应发生互补；特别是在引物3'端最好有富有GC，这样退火后有利于3'端的延伸。人工合成的引物需经过色谱层析或PAGE纯化，以除去未能合成至全长的短链等杂质。引物的终浓度一般为0.1-1μM左右，浓度太高会导致非特异性扩增，太低则扩增产物太少。
2、模板
模板可以是单链DNA，也可以是双链DNA，质粒DNA的扩增效率略低于线状DNA。模板量一般不需太多，不超过1μg为宜，因为模板量过多可能导致非特异性扩增增加，但是要考虑模板中靶序列的含量。例如：使用基因组为模板扩增单拷贝或低拷贝靶序列，就需要适当加大模板用量。
3、缓冲液buffer
缓冲液的PH值，盐离子浓度、助溶剂成分等都会对PCR反应产生影响。Taq酶通用缓冲液PH值为8.4。Mg2+浓度为1.5mM，可以适用于大多数PCR反应，但它并非对任何模板和引物的组合都是最佳的。
4、DNA聚合酶
50μl反应体系可用0.5-5U酶，酶量的选择与模板DNA的量、扩增片段大小等有关，酶量过多易发生非特异性反应，而且可能增加突变的机率，尤其在进行高保真扩增时，应尽量减少酶量，但酶量过少时反应性能会下降。
