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上海邦景实业有限公司
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转化细胞实验材料准备步骤
2021-1-14 阅读(311)
转化细胞实验材料准备：
1. 器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5 ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴(或恒温水浴锅)，制冰机，恒温摇床，培养皿(已铺好固体LB-Amp)，超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。
2. 试剂
培养基(不加抗菌素)，LB培养基(加抗菌素)，无菌ddH2O，IPTG，X-gal。
3. 材料处理
无菌ddH2O，1.5 ml 离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌)，20%IPTG(M/V)，2% X-gal(M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配)。
转化细胞操作步骤：
1. 事先将恒温水浴的温度调到42℃。
2. 从-70℃ 超低温冰柜中取出一管(100 μl)感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10 min。
3. 加入5 μl 连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100 ng)，轻轻震荡后放置冰上20 min。
4. 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2 min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5 min。
5. 在超净工作台中向上述各管中分别加入500 μl LB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1 h。
6. 在超净工作台中取上述转化混合液100-300 μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
7. 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40 μl 2% X-gal，8 μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
8. 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30~60 min 直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。
9. 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。
10. 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。
