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小鼠脾脏CD8+T细胞的磁珠分选
2024-6-20 阅读(1426)
一、制备脾脏单细胞悬液
8周龄C57BL/6小鼠摘眼球放血，无菌分离脾脏，于70um滤网上研磨收集脾细胞，过滤、离心，再以RPMI-1640wan全培养液重悬。
二、磁珠标记
1. 细胞计数为8×107/mL。
2. 400×g离心4分钟，去除上清。
3.每107个细胞总量使用40μL缓冲液重悬。
4.每107个细胞总量添加10μL CD8+T细胞生物su抗体混合物。
5.混匀，4℃孵育 5分钟。
6.每107个细胞加入2mL缓冲液洗涤细胞，400×g离心4分钟，去上清。
7.每107个细胞添加80μL 缓冲液。
8.每107个细胞添加20μL抗生物su磁珠。
9.混匀，4℃孵育 10分钟。
三、磁珠细胞分选
1. 将LS分选柱置于相对应的分选器中。
2. 用适当体积的缓冲液润洗分选柱.
3. 将细胞悬液转移至分选柱中，收集含有未标记细胞的流出液，即 CD8+T细胞。
4. 加适量的缓冲液，收集总流出物，并与步骤3中的流出液混合，这是CD8+T细胞。
四、流式鉴定
1. 将磁珠分选后得到的CD8+T细胞悬液离心，400 ×g，4min，弃去上清。
2. 细胞沉淀中加入1 mLwan全培养基，计数。
3. 从中取出两份细胞（一份大概1×106个细胞），设置为blank和CD8+T染色组。
4. CD8+T染色组加入200 μL流式染色缓冲液，再加入5 μL Anti-Mo CD8a，吹打均匀，常温避光孵育15min；
5. 孵育结束后，PBS洗涤细胞，离心去上清；
6. 加入200 μL流式染色缓冲液，上机检测。
