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上海劲马实验设备有限公司作者
SYSTEMS ® 中文说明书 UNIONHONEST
酶联免疫吸附测试
Enzyme linked lmmunosorbent Assay
_____________________________________________________________________________________
人
（
Human
）
转移趋化生长因子
beta1
（
TGF-beta1
）
ELISA
检测试剂盒
本试剂仅供研究使用
试验原理
：
TGF-beta1
试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（
ELISA
）
.
已知
TGF-beta1
浓度的标准品、未知浓度的样品
加入微孔酶标板内进行检测。先将
TGF-beta1
和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的
HRP
。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物
A
、
B
，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中
TGF-beta1
的浓度呈比例关系。
试剂盒内容及其配制
：
|
试剂盒成份
|
96
孔配置
|
48
孔配置
|
|
96/48
人份酶标板
|
1
块板（
96T
）
|
半块板（
48T
）
|
|
塑料膜板盖
|
1
块
|
半块
|
|
标准品：
1000pg/ml
|
1
瓶（
1.0ml
）
|
1
瓶（
0.5ml
）
|
|
空白对照
|
1
瓶（
1.0ml
）
|
1
瓶（
0.5ml
）
|
|
标准品稀释缓冲液
|
1
瓶（
8.0ml
）
|
1
瓶（
4.0ml
）
|
|
生物素标记的抗
TGF-beta1
抗体
|
1
瓶（
8.0ml
）
|
1
瓶（
4.0ml
）
|
|
亲和链酶素
-HRP
|
1
瓶（
12ml
）
|
1
瓶（
5ml
）
|
|
洗涤缓冲液
|
1
瓶（
20ml
）
|
1
瓶（
10ml
）
|
|
底物
A
|
1
瓶（
6.0ml
）
|
1
瓶（
3.0ml
）
|
|
底物
B
|
1
瓶（
6.0ml
）
|
1
瓶（
3.0ml
）
|
|
终止液
|
1
瓶（
6.0ml
）
|
1
瓶（
3.0ml
）
|
自备材料
：
1.
蒸馏水。
2.
加样器：
5ul
、
10ul
、
50ul
、
100ul
、
200ul
、
500ul
、
1000ul
。
3.
振荡器及磁力搅拌器等。
样品收集、处理及保存方法
：
1、
血清
……操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原
和内毒素的试管。收集血液后，1000
×
g
离心
10
分钟将血红
细胞迅速小心地分离。
2
、
血浆
……EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000
×
g
离心
30
分钟去除颗粒。
3
、
细胞上清液
……1000
×
g
离心
10
分钟去除颗粒和聚合物。
4
、
组织匀浆
……将组织加入适量生理盐水捣碎。1000
×
g
离心
10
分钟，取上清液。
5
、
保存
……如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
操作注意事项
：
●
试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
●
实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
●
不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
●
使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物
A
、
B
液时，避免使用带金属部分的加样器。
●
使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
●
底物
A
应挥发，避免长时间打开盖子。底物
B
对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取
OD
值。
●
加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
●
按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
安全性
：
1.
避免直接接触终止液和底物
A
、
B
，一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
2.
实难中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3.
不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
试剂的准备
：
1.
标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：
|
1000
pg/ml
|
（6号标准品）
|
原倍浓度不用稀释直接加入50ul
|
|
500
pg/ml
|
（5号标准品）
|
100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液
|
|
250
pg/ml
|
（4号标准品）
|
100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液
|
|
125
pg/ml
|
（3号标准品）
|
100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液
|
|
62.5
pg/ml
|
（2号标准品）
|
100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液
|
|
31.5
pg/ml
|
（1号标准品）
|
100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液
|
|
0
pg/ml
|
（空白对照）
|
原倍浓度不用稀释直接加入50ul
|
2.
洗涤缓冲液（
50×
）的稀释：蒸馏水
50
倍稀释。
试剂盒性能
：
1.
灵敏度：zui小的检测浓度小于
1
号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数
R
值为
0.990
。
2.
特异性：不与其它细胞因子反应。
3.
重复性：板内、板间变异系数均小于
10%
。
操作步骤
：
1.
使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2.
根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
3.
加入稀释好后的标准品
50
ul
于反应孔、加入待测样品
50
ul
于反应孔内。立即加入
50
ul
的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，
37
℃
温育45分钟。
4.
甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5.
每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6.
甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7.
每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。
8.
取出酶标板，迅速加入
50
ul
终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9.
在
450
nm
波长处测定各孔的
OD
值。
结果判断与分析
：
1、
仪器值：于波长
450nm
的酶标仪上读取各孔的
OD
值
2、
以吸光度
OD
值为纵坐标（
Y
），相应的
TGF-beta1
标准品浓度为横坐标（
X
），做得相应的曲线，样品的
TGF-beta1
含量可根据其
OD
值由标准曲线换算出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与
OD
值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的
OD
值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
3、
检测值范围：
0-1000pg
/ml
4、
敏感度：
3.9pg
/ml
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