人真胰岛素（TI）ELISA测定试剂盒

人真胰岛素（TI）ELISA测定试剂盒

本试剂盒仅供体外研究使用

预期应用

ELISA 法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中 TI 含量。

实验原理

用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗 TI 抗体的微孔中依次加入标本或标准品、*化的抗 TI 抗体、 HRP 标记的 亲和素 ，经过*洗涤后用底物 TMB 显色。 TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的 TI 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制

1. 酶联板： 一块（ 96 孔）

2. 标准品 （冻干品）： 2 瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至 1ml ，盖好后静置 10 分钟以上，然后反复颠倒 / 搓动以助溶解，其浓度为 200 pmol/L ，做系列倍比稀释 （ 注：不要直接在板中进行倍比稀释 ） 后，分别稀释成 200 pmol/L ， 100 pmol/L ， 50 pmol/L ， 25 pmol/L ， 12.5 pmol/L ， 6.25 pmol/L ， 3.12 pmol/L ，样品稀释液直接作为标准浓度 0 pmol/L ，临用前 15 分钟内配制。

如配制 100 pmol/L 标准品：取 0.5ml （ 不要少于 0.5ml ） 200 pmol/L 的上述标准品加入含有 0.5ml 样品稀释液的 Eppendorf 管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3. 样品稀释液 ： 1 × 20ml/ 瓶。

4. 检测稀释液 A ： 1 × 10ml/ 瓶。

5. 检测稀释液 B ： 1 × 10ml/ 瓶。

6. 检测溶液 A ： 1 × 120ul/ 瓶（ 1:100 ）临用前以检测稀释液 A 1:100 稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（ 100ul/ 孔），实际配制时应多配制 0.1-0.2ml 。如 10ul 检测溶液 A 加 990ul 检测稀释液 A 的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

7. 检测溶液 B ： 1 × 120ul/ 瓶（ 1:100 ）临用前以检测稀释液 B 1:100 稀释。稀释方法同检测溶液 A 。

8. 底物溶液 ： 1 × 10ml/ 瓶。

9. 浓洗涤液 ： 1 × 30ml/ 瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释 25 倍。

10. 终止液 ： 1 × 10ml/ 瓶（ 2N H₂SO4 ）。

11. 覆膜 ： 1 × 5 张

标本的采集及保存

1. 血清：全血标本请于室温放置 2 小时或 4 ℃过夜后于 1000 x g 离心 20 分钟，取上清即可检测， 或将标本放于 -20 ℃或-80℃保存，但 应避免反复冻融。

2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于 2 - 8° C 1000 x g 离心 15 分钟，或 将标本放于 -20 ℃或-80℃保存，但 应避免反复冻融。

3. 细胞培养物上清或其它生物标本：请 1000 x g 离心 20 分钟，取上清即可检测， 或将标本放于 -20 ℃或-80℃保存，但 应避免反复冻融。

注：以上标本置 4 ℃保存应小于 1 周， -20 ℃或-80℃均应 密封保存 ， -20 ℃不应超过1个月，-80℃不应超过2个月； 标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测；高血脂的标本不需进行特殊处理，可直接检测。

操作步骤

实验开始前，请提前配制好所有试剂；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，均应用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。建议各实验室在操作前*行预实验以建立*稀释倍数。

1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100ul ，余孔分别加标准品或待测样品 100ul ，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜， 37 ℃ 反应 120 分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液 A 工作液 100ul （在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜 , 37 ℃ 反应 60 分钟。

3. 温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分钟， 350ul/ 每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4. 每孔加检测溶液 B 工作液（同检测 A 工作液） 100ul ，酶标板加上覆膜 37 ℃ 反应 60 分钟。

5. 温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2 分钟， 350ul/ 每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6. 依序每孔加底物溶液 90ul ，酶标板加上覆膜 37 ℃避光 显色 （ 30 分钟内，此时肉眼可见标准品的前 3-4 孔有明显的梯度兰色，后 3-4 孔梯度不明显，即可终止）。

7. 依序每孔加终止溶液 50ul ，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8. 用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔的光密度（ OD 值）。 在加终止液后立即进行检测。

注 ：

1. 每次实验留一孔作为空白调零孔（不同于空白孔），该孔不加任何试剂，只是zui后加底物溶液及 2N H₂SO4 。测量时先用此孔调 OD 值至零。

2. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室 温。使用后立即冷藏保存试剂。

3. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入检测溶液 B 或底物前确保尽量吸干孔内液体。为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，避免酶标板长时间处于干燥状态。

4. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响 OD 值。

5. 在储存和温育时避免强光直接照射。

6. 未使用完的酶标板或者试剂，请于 2-8 ℃保存。标准品、检测溶液 A 工作液、检测溶液 B 工作液请依据所需的量配置使用，请配置标准品及工作液，尽量不要微量配置（如吸取检测溶液 A 时，一次不要小于 10ul ），以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差；检测液 A 、 B ，以及底物溶液在使用前，应置于 37 ℃温育 30 分钟；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液 A 工作液或检测溶液 B 工作液。

7. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层 吸 水

纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少 0.3ml 注入孔内，浸泡 1-2 分钟，根据需

要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

特异性

本试剂盒可同时检测重组或天然的人 TI ，且与其它相关蛋白无交叉反应。

计算

以标准物的浓度为横坐标（对数坐标）， OD 值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线（推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如 curve expert 1.3 ），根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项

1. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

2. 一次加样时间控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用多道移液器加样。

3. 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。

4. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释倍数。

5. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。

6. 底物请避光保存。

检测范围： 3.12 pmol/L - 200 pmol/L

zui低检测限 ： 0.78 pmol/L

说明

1. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。

2. 小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本 / 标准品，酶结合物或底物时，*个孔与zui后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。而且，洗涤不充分将影响试验结果。

3. 试剂盒保存：部分试剂保存于 -20 ℃，部分试剂保存于 2-8 ℃，具体以标签上的标示为准。

4. 浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

5. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。

6. 所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

7. 有效期： 6 个月

厦门慧嘉生物科技有限公司专业 代理众多生命科学领域的。致力于各种 ELISA 试剂盒 、免疫组化试剂盒、 一抗二抗 、细胞因子、生物试剂、移液器、耗材的销售推广及服务工作。
咨询 ：

人真胰岛素（TI）ELISA测定试剂盒