大鼠*原激活肽（TAP）ELISA试剂盒使用说明书

大鼠*原激活肽 （TAP）ELISA 试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供体外研究使用 !

预期应用

ELISA 法定量测定大鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中 *原激活肽 （TAP） 含量。

实验原理

用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗 TAP 抗体的微孔中依次加入标本或标准品、*化的抗 TAP 抗体、 HRP 标记的 亲和素 ，经过*洗涤后用底物 TMB 显色。 TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的 TAP 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制

1. 酶联板： 一块（ 96 孔）

2. 标准品 （冻干品）： 2 瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至 1ml ，盖好后静置 10 分钟以上，然后反复颠倒 / 搓动以助溶解，其浓度为 10 nmol/L ，做系列倍比稀释 （ 注：不要直接在板中进行倍比稀释 ） 后，分别稀释成 10 nmol/L ， 5 nmol/L ， 2.5 nmol/L ， 1.25 nmol/L ， 0.625 nmol/L ， 0.312 nmol/L ， 0.156 nmol/L ，样品稀释液直接作为标准浓度 0 nmol/L ，临用前 15 分钟内配制。如配制 5 nmol/L 标准品：取 0.5ml （ 不要少于 0.5ml ） 10 nmol/L 的上述标准品加入含有 0.5ml 样品稀释液的 Eppendorf 管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3. 样品稀释液 ： 1×20ml 。

4. 检测稀释液 A ： 1×10ml 。

5. 检测稀释液 B ： 1×10ml 。

6. 检测溶液 A ： 1×120μl （ 1:100 ）临用前以检测稀释液 A 1:100 稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（ 100μl/ 孔），实际配制时应多配制 0.1-0.2ml 。如 10μl 检测溶液 A 加 990μl 检测稀释液 A 的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

7. 检测溶液 B ： 1×120μl/ 瓶（ 1:100 ）临用前以检测稀释液 B 1:100 稀释。稀释方法同检测溶液 A 。

8. 底物溶液 ： 1×10ml/ 瓶。

9. 浓洗涤液 ： 1×30ml/ 瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释 25 倍。

10. 终止液 ： 1×10ml/ 瓶（ 2N H₂SO4 ）。

11. 覆膜 ： 5 张

12. 使用说明书： 1 份

自备物品

1. 酶标仪（建议参考仪器使用说明提前预热）

2. 微量加液器及吸头， EP 管

3. 蒸馏水或去离子水，全新滤纸

标本的采集及保存

1. 血清：全血标本请于室温放置 2 小时或 4 ℃ 过夜后于 1000 x g 离心 20 分钟，取上清即可检测， 或将标本放于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 保存，但应避免反复冻融。

2. 血浆：可用 EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后 30 分钟内于 2 - 8° C 1000 x g 离心 15 分钟，或 将标本放于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 保存，但应避免反复冻融。

3. 细胞培养物上清或其它生物标本：请 1000 x g 离心 20 分钟，取上清即可检测， 或将标本放于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 保存，但应避免反复冻融。

注：以上标本置 4 ℃ 保存应小于 1 周， -20 ℃ 或 -80 ℃ 均应 密封保存 ， -20 ℃ 不应超过 1 个月， -80 ℃ 不应超过 2 个月；标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

操作步骤

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在 37 ℃ 溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100μl ，余孔分别加标准品或待测样品 100μl ，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜， 37 ℃ 反应 120 分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液 A 工作液 100μl （在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜 , 37 ℃ 反应 60 分钟。

3. 温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分钟，大约 400μl/ 每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4. 每孔加检测溶液 B 工作液（同检测 A 工作液） 100μl ，酶标板加上覆膜 37 ℃ 反应 60 分钟。

5. 温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2 分钟， 350μl/ 每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6. 依序每孔加底物溶液 90μl ，酶标板加上覆膜 37 ℃ 避光显色 （ 30 分钟内，此时肉眼可见标准品的前 3-4 孔有明显的梯度兰色，后 3-4 孔梯度不明显，即可终止）。

7. 依序每孔加终止溶液 50μl ，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8. 用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔的光密度（ OD 值）。 在加终止液后立即进行检测。

注 ：

1. 试剂准备： 所有试剂都必须在使用前达到室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。

2. 加样： 加样或加试剂时，请注意在吸取标本 / 标准品，酶结合物或底物时，*个孔与zui后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “ 预孵育 ” 时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。 一次加样时间（包括标准品及所有样品）控制在 10 分钟内，如标本数量多，推荐使用多道移液器加样。

3. 孵育： 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态 ; 同时应 严格遵守给定的孵育时间和温度。

4. 洗涤 ：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响zui后的酶标仪读数。

5. 试剂配制： Detection A 及 Detection B 在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液 A 工作液、检测溶液 B 工作液请依据所需的量配置使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请配置标准品及工作液，尽量不要微量配置（如吸取检测溶液 A 时，一次不要小于 10μl ），以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液 A 工作液或检测溶液 B 工作液。

6. 反应时间的控制： 加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔 10 分钟），如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。

7. 底物： 底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。

建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。

如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释倍数。

洗板方法

1. 手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少 0.3ml 注入孔内，浸泡 1-2 分钟，根据需要，重复此过程数次。

2. 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

特异性

本试剂盒可同时检测重组或天然的大鼠 TAP ，且与其它相关蛋白无交叉反应。

计算

以标准物的浓度为纵坐标（对数坐标）， OD 值为横坐标（对数坐标），在对数坐标纸上绘出标准曲线。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如 curve expert 1.3 ，根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

检测范围： 0.156 nmol/L - 10 nmol/L

zui低检测限 ： 0.078 nmol/L

说明

1. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。

2. 试剂盒保存：短期（ 1 周以内）以标签上的标示为准，长期保存请将试剂全部保存于 -20 ℃ 。

3. 浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

4. 刚开启的酶联板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。

5. 所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

6. 有效期： 6 个月。

7. 本操作说明适用于 48T 试剂盒，但 48T 试剂盒所有试剂减半。

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