人*抗体（GM1）IgM试剂盒使用说明书

人*抗体 （GM1）IgM 试 剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用

zui低检测限： 1 ng/ml

特异性： 本试剂盒可同时检测人 GM1 （IgM） ，且与其他相关抗体无交叉反应。

有效期： 6 个月

预期应用： ELISA 法半定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中 GM1 （IgM） 含量。

说明

1 ．试剂盒保存： -20 ℃ （较长时间不用时）； 2 -8 ℃ （频繁使用时）。

2 ．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

3 ．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。

4 ．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。

实验原理

用 GM1 抗原包被酶标板，制成固相载体。向微孔中先加入待测样品进行反应，然后再加入辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 进行反应， 经过*洗涤后用底物 TMB 显色。 TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的 GM1 （IgM） 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），计算样品中抗体的效价（抗血清zui终能显色的zui高稀释倍数记为效价）。

试剂盒组成及试剂配制

1. 酶联板 （Assay plate ） ：一块（ 96 孔）。

2. 样品稀释液 （Sample Diluent ） ： 1×20ml/ 瓶。

3. 辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 稀释液 （ HRP-anti-human IgM Diluent ） ： 1×10ml/ 瓶。

4. 辣根过氧化物酶标记抗人 IgM （ HRP-anti-human IgM ） ： 1×120μl/ 瓶（ 1 ： 100 ）。

5. 底物溶液（ TMB Substrate ） ： 1×10ml/ 瓶。

6. 浓洗涤液（ Wash Buffer ） ： 1×20ml/ 瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释 25 倍。

7. 终止液（ Stop Solution ） ： 1×10ml/ 瓶（ 2N H₂SO4 ）。

需要而未提供的试剂和器材

1. 标准规格酶标仪

2. 高速离心机

3. 电热恒温培养箱

4. 干净的试管和 Eppendof 管

5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，用多通道移液器

6. 蒸馏水，容量瓶等

标本的采集及保存

1. 血清：全血标本请于室温放置 2 小时或室温 过夜后于 1000 x g 离心 20 分钟，取上清即可检测， 或将标本放于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 保存，但 应避免反复冻融。

2. 血浆：可用 EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后 30 分钟内于 2 - 8° C 1000 x g 离心 15 分钟，或 将标本放于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 保存，但 应避免反复冻融。

3. 细胞培养物上清或其它生物标本： 1000 x g 离心 20 分钟，取上清即可检测， 或将标本放于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 保存，但 应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

标本的稀释原则：

首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。稀释的过程中，应做好详细的记录。zui后计算抗体效价时，稀释了 “N” 倍，标本中抗体的效价为 “N” 。

辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 的稀释原则：

临用前以辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔 100μl ），实际配制时应多配制 0.1-0.2ml 。如 10μl 辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 加 990μl 辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

操作步骤

实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

1. 加样：分别设空白孔、 待测样品孔。空白孔 加样品稀释液 100μl ， 余孔加待测样品 100 μl ，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜， 37℃ 反应 120 分钟。

2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 工作液 100μl （取 1μl *标记抗体加 99μl *标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制）， 37℃ ， 60 分钟。

3. 温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2 分钟， 350μl/ 每孔，甩干。

4. 依序每孔加底物溶液 90μl ， 37℃ 避光显色（ 30 分钟内，此时肉眼可见孔内有明显蓝色，即可终止）。

5. 依序每孔加终止溶液 50μl ，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

6. 用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔的光密度（ OD 值）。 在加终止液后 15 分钟以内进行检测。

注 ：

1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。

2. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是zui后加底物溶液及 2N H₂SO4 。测量时先用此孔调 OD 值至零。

3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。

4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于 2-8℃ 保存。辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 工作液。

5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少 0.3ml 注入孔内，浸泡 1-2 分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

计算

为检测样品中 GM1 （IgM） 效价，客户可以采取样品 2 倍倍比稀释样品计算抗体效价，一般采取以 1:40 为起始稀释倍数（使用样品稀释液进行稀释）。zui大稀释倍数根据客户自身试验要求而定，zui终显色与阴性对照孔进行比较，有明显差异的zui大稀释度定为抗体的zui终效价。

注意事项

1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。

2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

3. 一次加样时间控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释倍数。

5. 在配制检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。

6. 底物请避光保存。

7. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。

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