*梯度溶液分离动物细胞核

试剂和器材：

1. OptiPrepTM（600g*，ρ=1.32g/ml）；

2. OptiPrepTM稀释剂（OptiPrepTM diluent，OD）：150mmol/L KCl、30mmol/L MgCl2、120mmol/L*基*-KOH，pH7.8；

3. 匀浆介质（HM）：0.25mol/L蔗糖、25mmol/L KCl、5mmol/L MgCl2、20mmol/L*基*-KOH，pH7.8；按要求向OptiPrepTM稀释剂和匀浆介质中加入蛋白酶抑制剂；

4. 高转矩桥式电动机（半导体开关控制）；

5. Potter-Elvehjem匀浆器，20—40ml，孔隙约0.07mm；

6. 高速离心机，带可容纳15—50ml离心管的吊桶式转子；

7. 注射器，带金属*（内径约0.8mm）；

8. 尼龙滤网。

实验方法：

所有操作在0—4℃下进行。

1. 制备500g/L*工作液：每5倍体积OptiPrepTM用1倍体积的OptiPrepTM稀释剂来稀释；

2. 梯度溶液：用匀浆介质（分别为6倍体积+4倍体积和7倍体积+3倍体积）来稀释500g/L*工作液以制备300g/L和350g/L的两种*梯度溶液。保持于冰上。

3. 切除肝脏并用剪刀剪切成微小碎块；

4. 将大约一半肝脏转移到Potter-Elvehjem匀浆器的20ml匀浆介质中，并用研杵研磨约8次，在约500r/min转速下旋转以破碎组织；

5. 对另一半肝脏切碎物重复以上操作；

6. 用尼龙滤网过滤；

7. 通过与等体积的500g/L*工作液混合将匀浆液调整到250g/L*；

8. 将10—15ml匀浆液转移到50ml管中，从300g/L和350g/L的*梯度溶液中各取10ml加到匀浆液之下；

9. 在100000g下离心20min；

10. 细胞核在300g/L和350g/L*界面上成带，用注射器和金属*吸取细胞核；

11. 用2倍体积的匀浆介质稀释悬液，在2000g下离心10min沉淀细胞核。

原文地址:/biotech/exp/molbio/Molecular/2011/x816372438.html